化妆品毒理学替代试验及其检测体系的研究

成果基本信息
关键词：	化妆品;体外试验;检测
成果类别：	应用技术	技术成熟度：	成熟应用阶段
体现形式（基础理论类）：		体现形式（应用技术类）：	行业标准
成果登记号：	9312012Y2353	资源采集日期：	2013-02-20

研究情况
单位名称：	上海出入境检验检疫局	技术水平：	国际先进
评价证书号：		评价单位：
评价日期：	2011.12.16	评价证书号：

转化情况
转让范围：	允许出口	推广形式：	技术服务
已转让企业数（个）：	0

联系方式
联系人（平台）：	孵化基地	联系人（平台）电话：	0771-3394012
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成果简介
（一）课题来源与背景近二十年来，干扰人类和野生动物内分泌系统的环境化学物引起了人们广泛关注。研究表明，多种疾病与工业化进程的化学物暴露的增加有关，如生殖系统异常，激素相关的肿瘤，肥胖，型糖尿病等，这些化学物对人类和野生动物的生殖构成严重威胁。这些环境内分泌干扰物能够通过空气，水或污染区转运进入人体，特别是这些物质的生物蓄积和生物放大作用使得食物链的首部处于危险之中，其对食品的安全产生威胁。当前，应对食品、农产品中环境内分泌干扰物的污染已成为人们迫切需要解决的难题。环境抗雄激素是环境内分泌干扰物的重要部分之一，由于雄激素在雄性显型表达中起着关键的作用，以及AR在性分化和发育过程介导雄激素作用的重要性，环境抗雄激素暴露可能对雄性生殖系统发育产生不良影响，可以引起雄性生殖系统发育和功能异常，表现为尿道下裂等泌尿生殖道畸形、隐睾的发病率增高，雄性乳头残留，生殖器与肛门距离缩短，睾丸和附睾萎缩，精液量和精子数减少，精子活动度降低，精子畸形率升高等。环境抗雄激素暴露可能对雄性生殖系统发育产生不良影响，随着越来越多的化学物质被鉴定为环境抗雄激素，迫切需要建立一套能快速筛选环境抗雄激素的方法，从而对食品中环境抗雄激素残留检测，为食品安全的质量控制和监督提供有力的技术保障。在此背景下，本项目得到上海出入境检验检疫局科研项目的经费资助，建立的抗雄激素生物学方法体外和体内组合试验方法，其中体外试验包括体外方法如基于MDA-kb2和HepG2细胞的报告基因试验（转录活化试验）和雄激素受体(AR)结合试验，体内动物试验包括Hershberger试验。体外试验快速简便、敏感性高、机理明确、条件易控制、其它影响因素少，是内分泌干扰物快速筛检较为理想的方法。体内Hershberger 试验较为敏感，可以弥补体外试验的不足，如限制于特定的机制，缺少代谢活化以及化学物吸收、分布、代谢和排泄的信息。体内和体外试验的组合能够实现快速、准确、高效地筛选出食品的农药或其他环境化学物中的抗雄激素内分泌干扰物的残留。（二）技术原理及性能指标本课题建立的抗雄激素生物学方法体外和体内组合试验，体外试验包括体外方法如基于MDA-kb2和HepG2细胞的报告基因试验（转录活化试验）和雄激素受体(AR)结合试验，体内动物试验包括Hershberger试验。体外试验快速简便、敏感性高、机理明确、条件易控制、其它影响因素少，能够检测出微量农药以及环境化学物的抗雄激素残留，是内分泌干扰物快速筛检较为理想的方法。体内Hershberger试验较为敏感，可以弥补体外试验的不足，如限制于特定的机制，缺少代谢活化以及化学物吸收、分布、代谢和排泄的信息。体内和体外试验的组合能够实现快速、准确、高效地筛选出食品的农药或其他环境化学物中的抗雄激素内分泌干扰物的残留。基于EDCs和AR相互作用的生物学方法能够检测总的雄激素活性的EDCs，具有理化分析所不具备的优势，具有敏感性高、机理明确、易控制、影响因素少的优点，是筛检和监测内分泌干扰物较为理想的方法。 (1)建立基于MDA-kb2细胞的体外雄激素报告基因试验方法。稳定表达雄激素依赖报告基因的细胞株MDA-kb2是把MMTV.luciferase.neo报告基因质粒稳定转染到人乳腺癌细胞株MDA-MB-453而得，雄激素依赖荧光素酶报告基因质粒由雄激素依赖强启动子－MMTV promoter驱使。该细胞得自单个稳定得细胞克隆，对AR介导的反应性能够维持到几十代而无需重复转染，试验内和试验间的可变性得到了很大程度的减小，便于有效标准化。还因能以96孔板的形式进行试验，并且2天内完成检测而实现一定程度的高通量筛选。用该细胞的转录活化试验方法能灵敏而又特异地检测与AR相互作用的化学物，并能区分AR激动剂与AR拮抗剂。 (2)建立基于HepG2细胞的体外雄激素报告基因试验方法。本试验将人雄激素受体表达质粒pSVAR0及雄激素反应元件调控的报告质粒pMMTV-Lue转入HepG2细胞，使其表达AR，并带有雄激素反应元件，从而可与具有（抗）雄激素样活性的化学物反应，引起Luc荧光素酶的表达。 (3)建立雄激素受体结合试验方法。雄激素受体结合试验主要用于评价受试物与雄激素受体结合的能力，其利用动物雄激素依赖组织的受体与化学物结合，计算受试物相对亲和力大小。本试验所需时间短，可用于大规模筛选，但它只能说明与AR的亲和力，而不能区分是AR激动剂或拮抗剂。 (4)建立体内Hershberger试验方法。Hershberger试验是美国EPA推荐作为环境内分泌干扰物筛检方案的一部分，用来筛检环境化学物的抗雄激素作用。由于该方法去除了经典的内分泌反馈通路，对抗雄激素极为敏感。但是，雄激素依赖组织重量改变作为雄激素反应之一可由多种机制引起，包括雄激素各反应环节的改变和其他因素对雄激素反应的间接作用。 1.本课题组在专业杂志中发表论文3篇。 1.The antiandrogenic activity of pyrethroid pesticides cyfluthrin and β-cyfluthrin,Reproductive Toxicology 25(2008)491-496; 2.氯氰菊酯和高效氯氰菊酯的抗雄激素活性研究，中华劳动卫生职业病杂志 2008年4月第26卷第4期； 3.Anti‐androgenic effects of Di(2‐ethylhexyl)phthalate on immature male Sprague‐Dawley rats,第6届亚洲毒理学会议论文（三）技术创造性与先进性本项目的研究成果可用于进出口食品及食品添加剂中抗雄激素物质残留的快速筛选和验证，可用于食品抗雄激素内分泌干扰我残留的快速检测。 (1)可应用于食品、食品添加剂及食品残留化学物抗雄激素效应的检测，为进出口贸易提供技术支撑。近年来，食品安全事故频发发生，其中食品中化学物残留的污染十分普遍，EDCs广泛存在于工业废水、废气和生活污水中，我们的日常生活如合成洗涤剂、化妆品、农药及其降解物，用聚氯乙烯为原料的用品、含苯乙烯的聚氯乙烯方便盒、金属罐头内的金属防腐膜，垃圾焚烧产生的污染物等，还可能进入整个食物链，通过食品、动物饲料、水、空气等进人机体，并在体内直接或间接影响正常的激素代谢，因此，对这些物质的抗雄激素效应检测十分必要，本研究所建立的抗雄激素内分泌干扰物的组合检测方法适用抗雄激素物质残留的快速筛选和检测； (2)本研究采用体内和体外方法相结合筛选和检测出食品中具有抗雄激素作用的环境化学物残留；体外基于MDA-kb2和HepG2细胞的抗雄激素报告基因试验和雄激素受体结合试验和体内Hershberger试验的组合方法，体外试验快速简便、敏感性高、机理明确、条件易控制、其它影响因素少，是内分泌干扰物快速筛检较为理想的方法。体内Hershberger 试验较为敏感，可以弥补体外试验的不足，如限制于特定的机制，缺少代谢活化以及化学物吸收、分布、代谢和排泄的信息。体内和体外试验的组合能够实现快速、准确、高效地筛选出食品的农药或其他环境化学物中的抗雄激素内分泌干扰物的残留； (3)环境中存在的众多EDCs通常以混合物的形式存在，分析化学的方法不能检测出样品的所有EDCs，且不能考虑混合物之间的相互作用，不能确定混合物的生物学效应.对于抗雄激素的生物学检测国内尚无相关标准，本研究所建立的方法适用于检验检疫系统对环境激素类化学物进行快速筛选，能够对食品安全的质量控制和监督提供有力的技术保障。（四）技术成熟程度，适用范围和安全性本研究采用的多种生物学检测方法检测食品中环境抗雄激素残留，方法较为快速、准确、高效，能够有效地检测出化学物的抗雄激素效应，各个方法原理和检测终点均不同，从不同角度、机制检测受试物的抗雄激素活性，非常适合作为食品的农药或其他环境化学物中的抗雄激素内分泌干扰物的残留的筛选组合试验，基于EDCs和AR相互作用的生物学方法能够检测总的雄激素活性的EDCs，具有理化分析所不具备的优势，具有敏感性高、机理明确、易控制、影响因素少的优点，是筛检和监测内分泌干扰物较为理想的方法，能够对食品安全的质量控制和监督提供有力的技术保障。（五）应用情况及存在的问题本研究包括食品中环境抗雄激素化合物生物学检测方法，各个方法有各自优缺点，我们认为有必要进行深入的研究，从不同角度研究各种方法的适用条件，形成环境抗雄激素的组合方法，对各种方法的准确性的研究将会更趋于完美。

成果名称：	化妆品毒理学替代试验及其检测体系的研究	关键词：	化妆品;体外试验;检测
成果类别：	应用技术	一级分类名称：	医学生物工程
二级分类名称：		三级分类名称：
研究起止时间：	2009.01 至2010.12	成果体现形式（应用技术类）：	行业标准
成果属性：	原始性创新	成果体现形式（基础理论类）：
技术成熟度：	成熟应用阶段	技术水平：	国际先进
研究形式：	独立研究	学科分类1：	国家标准GB T13745-92《学科分类与代码》
单位名称：	上海出入境检验检疫局	学科分类2：	530.54
中图分类号1：	中国图书资料分类法（第四版）	所属高新技术类别：	生物、医药和医疗器械
中图分类号2：	TQ658	课题来源：	部门计划
应用行业：	卫生、社会保障和社会福利业	课题立项名称：
国家科技计划子类别：		课题立项编号：	HK007-2008
经费实际投入额（万元）：	20.00	评价单位：
评价形式：	鉴定	应用状态：	稳定应用
评价日期：	2011.12.16	转让范围：	允许出口
评价证书号：		推荐单位：	中华人民共和国上海出入境检验检疫局
推广形式：	技术服务	成果登记号：	9312012Y2353
成果简介：	（一）课题来源与背景近二十年来，干扰人类和野生动物内分泌系统的环境化学物引起了人们广泛关注。研究表明，多种疾病与工业化进程的化学物暴露的增加有关，如生殖系统异常，激素相关的肿瘤，肥胖，型糖尿病等，这些化学物对人类和野生动物的生殖构成严重威胁。这些环境内分泌干扰物能够通过空气，水或污染区转运进入人体，特别是这些物质的生物蓄积和生物放大作用使得食物链的首部处于危险之中，其对食品的安全产生威胁。当前，应对食品、农产品中环境内分泌干扰物的污染已成为人们迫切需要解决的难题。环境抗雄激素是环境内分泌干扰物的重要部分之一，由于雄激素在雄性显型表达中起着关键的作用，以及AR在性分化和发育过程介导雄激素作用的重要性，环境抗雄激素暴露可能对雄性生殖系统发育产生不良影响，可以引起雄性生殖系统发育和功能异常，表现为尿道下裂等泌尿生殖道畸形、隐睾的发病率增高，雄性乳头残留，生殖器与肛门距离缩短，睾丸和附睾萎缩，精液量和精子数减少，精子活动度降低，精子畸形率升高等。环境抗雄激素暴露可能对雄性生殖系统发育产生不良影响，随着越来越多的化学物质被鉴定为环境抗雄激素，迫切需要建立一套能快速筛选环境抗雄激素的方法，从而对食品中环境抗雄激素残留检测，为食品安全的质量控制和监督提供有力的技术保障。在此背景下，本项目得到上海出入境检验检疫局科研项目的经费资助，建立的抗雄激素生物学方法体外和体内组合试验方法，其中体外试验包括体外方法如基于MDA-kb2和HepG2细胞的报告基因试验（转录活化试验）和雄激素受体(AR)结合试验，体内动物试验包括Hershberger试验。体外试验快速简便、敏感性高、机理明确、条件易控制、其它影响因素少，是内分泌干扰物快速筛检较为理想的方法。体内Hershberger 试验较为敏感，可以弥补体外试验的不足，如限制于特定的机制，缺少代谢活化以及化学物吸收、分布、代谢和排泄的信息。体内和体外试验的组合能够实现快速、准确、高效地筛选出食品的农药或其他环境化学物中的抗雄激素内分泌干扰物的残留。（二）技术原理及性能指标本课题建立的抗雄激素生物学方法体外和体内组合试验，体外试验包括体外方法如基于MDA-kb2和HepG2细胞的报告基因试验（转录活化试验）和雄激素受体(AR)结合试验，体内动物试验包括Hershberger试验。体外试验快速简便、敏感性高、机理明确、条件易控制、其它影响因素少，能够检测出微量农药以及环境化学物的抗雄激素残留，是内分泌干扰物快速筛检较为理想的方法。体内Hershberger试验较为敏感，可以弥补体外试验的不足，如限制于特定的机制，缺少代谢活化以及化学物吸收、分布、代谢和排泄的信息。体内和体外试验的组合能够实现快速、准确、高效地筛选出食品的农药或其他环境化学物中的抗雄激素内分泌干扰物的残留。基于EDCs和AR相互作用的生物学方法能够检测总的雄激素活性的EDCs，具有理化分析所不具备的优势，具有敏感性高、机理明确、易控制、影响因素少的优点，是筛检和监测内分泌干扰物较为理想的方法。 (1)建立基于MDA-kb2细胞的体外雄激素报告基因试验方法。稳定表达雄激素依赖报告基因的细胞株MDA-kb2是把MMTV.luciferase.neo报告基因质粒稳定转染到人乳腺癌细胞株MDA-MB-453而得，雄激素依赖荧光素酶报告基因质粒由雄激素依赖强启动子－MMTV promoter驱使。该细胞得自单个稳定得细胞克隆，对AR介导的反应性能够维持到几十代而无需重复转染，试验内和试验间的可变性得到了很大程度的减小，便于有效标准化。还因能以96孔板的形式进行试验，并且2天内完成检测而实现一定程度的高通量筛选。用该细胞的转录活化试验方法能灵敏而又特异地检测与AR相互作用的化学物，并能区分AR激动剂与AR拮抗剂。 (2)建立基于HepG2细胞的体外雄激素报告基因试验方法。本试验将人雄激素受体表达质粒pSVAR0及雄激素反应元件调控的报告质粒pMMTV-Lue转入HepG2细胞，使其表达AR，并带有雄激素反应元件，从而可与具有（抗）雄激素样活性的化学物反应，引起Luc荧光素酶的表达。 (3)建立雄激素受体结合试验方法。雄激素受体结合试验主要用于评价受试物与雄激素受体结合的能力，其利用动物雄激素依赖组织的受体与化学物结合，计算受试物相对亲和力大小。本试验所需时间短，可用于大规模筛选，但它只能说明与AR的亲和力，而不能区分是AR激动剂或拮抗剂。 (4)建立体内Hershberger试验方法。Hershberger试验是美国EPA推荐作为环境内分泌干扰物筛检方案的一部分，用来筛检环境化学物的抗雄激素作用。由于该方法去除了经典的内分泌反馈通路，对抗雄激素极为敏感。但是，雄激素依赖组织重量改变作为雄激素反应之一可由多种机制引起，包括雄激素各反应环节的改变和其他因素对雄激素反应的间接作用。 1.本课题组在专业杂志中发表论文3篇。 1.The antiandrogenic activity of pyrethroid pesticides cyfluthrin and β-cyfluthrin,Reproductive Toxicology 25(2008)491-496; 2.氯氰菊酯和高效氯氰菊酯的抗雄激素活性研究，中华劳动卫生职业病杂志 2008年4月第26卷第4期； 3.Anti‐androgenic effects of Di(2‐ethylhexyl)phthalate on immature male Sprague‐Dawley rats,第6届亚洲毒理学会议论文（三）技术创造性与先进性本项目的研究成果可用于进出口食品及食品添加剂中抗雄激素物质残留的快速筛选和验证，可用于食品抗雄激素内分泌干扰我残留的快速检测。 (1)可应用于食品、食品添加剂及食品残留化学物抗雄激素效应的检测，为进出口贸易提供技术支撑。近年来，食品安全事故频发发生，其中食品中化学物残留的污染十分普遍，EDCs广泛存在于工业废水、废气和生活污水中，我们的日常生活如合成洗涤剂、化妆品、农药及其降解物，用聚氯乙烯为原料的用品、含苯乙烯的聚氯乙烯方便盒、金属罐头内的金属防腐膜，垃圾焚烧产生的污染物等，还可能进入整个食物链，通过食品、动物饲料、水、空气等进人机体，并在体内直接或间接影响正常的激素代谢，因此，对这些物质的抗雄激素效应检测十分必要，本研究所建立的抗雄激素内分泌干扰物的组合检测方法适用抗雄激素物质残留的快速筛选和检测； (2)本研究采用体内和体外方法相结合筛选和检测出食品中具有抗雄激素作用的环境化学物残留；体外基于MDA-kb2和HepG2细胞的抗雄激素报告基因试验和雄激素受体结合试验和体内Hershberger试验的组合方法，体外试验快速简便、敏感性高、机理明确、条件易控制、其它影响因素少，是内分泌干扰物快速筛检较为理想的方法。体内Hershberger 试验较为敏感，可以弥补体外试验的不足，如限制于特定的机制，缺少代谢活化以及化学物吸收、分布、代谢和排泄的信息。体内和体外试验的组合能够实现快速、准确、高效地筛选出食品的农药或其他环境化学物中的抗雄激素内分泌干扰物的残留； (3)环境中存在的众多EDCs通常以混合物的形式存在，分析化学的方法不能检测出样品的所有EDCs，且不能考虑混合物之间的相互作用，不能确定混合物的生物学效应.对于抗雄激素的生物学检测国内尚无相关标准，本研究所建立的方法适用于检验检疫系统对环境激素类化学物进行快速筛选，能够对食品安全的质量控制和监督提供有力的技术保障。（四）技术成熟程度，适用范围和安全性本研究采用的多种生物学检测方法检测食品中环境抗雄激素残留，方法较为快速、准确、高效，能够有效地检测出化学物的抗雄激素效应，各个方法原理和检测终点均不同，从不同角度、机制检测受试物的抗雄激素活性，非常适合作为食品的农药或其他环境化学物中的抗雄激素内分泌干扰物的残留的筛选组合试验，基于EDCs和AR相互作用的生物学方法能够检测总的雄激素活性的EDCs，具有理化分析所不具备的优势，具有敏感性高、机理明确、易控制、影响因素少的优点，是筛检和监测内分泌干扰物较为理想的方法，能够对食品安全的质量控制和监督提供有力的技术保障。（五）应用情况及存在的问题本研究包括食品中环境抗雄激素化合物生物学检测方法，各个方法有各自优缺点，我们认为有必要进行深入的研究，从不同角度研究各种方法的适用条件，形成环境抗雄激素的组合方法，对各种方法的准确性的研究将会更趋于完美。
联系人：	周游	成果登记日期：	2012-11-20
联系人email：	zhouy@shciq.gov.cn	单位代码：	93100063
邮政编码222：	200135	联系人电话：	021-38620312
单位传真：	021-38620168	单位通讯地址：	上海市浦东新区民生路1208号
单位所在省市：	上海市	单位电话：	021-38620168
转让收入（万元）：	0	单位属性：	其他
合作完成单位：		已转让企业数（个）：	0
成果发布年份：	2012	知识产权形式：
成果完成人：	邱璐;李小林;刘俊平;王艳;蒋静;李健;钱平平	资源采集日期：	2013-02-20

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