大鼠正常与纤维化肝脏生物支架的比较研究

成果基本信息
关键词：	纤维化;去细胞;支架;ECM;2-DE
成果类别：		技术成熟度：
体现形式（基础理论类）：		体现形式（应用技术类）：	无
成果登记号：	17024009	资源采集日期：	2017-11-22

研究情况
单位名称：	温州医科大学	技术水平：
评价证书号：		评价单位：	浙江省教育厅
评价日期：	2014.06.20	评价证书号：

转化情况
转让范围：		推广形式：	无
已转让企业数（个）：	0

联系方式
联系人（平台）：	孵化基地	联系人（平台）电话：	0771-3394012
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成果简介
炎症损伤长期存在导致肝纤维化、肝硬化时，肝脏正常再生就会被抑制[4][5][6]，随着肝脏组织损伤加重，剩余正常部分肝功能失代偿时便导致肝功能衰竭。目前除肝移植外，尚无其他公认的治愈手段，但由于供体来源有限，需要终身服用免疫抑制剂，且治疗费用昂贵等限制了临床应用。肝脏组织工程学如生物人工肝、器官重构等研究领域的迅速发展为治疗肝功能衰竭提供了新路径，如何使去除实质细胞后的组织生物支架能够更好的、清晰的完整显示组织器官不溶性细胞外基质，最终能够血管化实现体内移植，是目前肝脏组织工程的核心研究内容和难点。　　本研究通过CCL4剂量个体化诱导大鼠肝纤维化模型（详见参考文献[13]），分别于模型诱导2周、4周、6周、8周取大鼠全肝标本，正常SD大鼠作为对照。AST和ALT检测及病理学检查，取部分肝脏组织用甲醛固定，观察肝组织病理改变。然后，取出部分肝脏，肝素PBS冲洗残留血液，至肝呈均一土黄色，进行分组，置于0.1%的Trypsin溶液中，恒温37℃，持续灌注（灌注压3.6mmHg）1-2h，超纯水1000ml，0.5%、1%SDS溶液1000ml12h（6h换液一次），或1%、3%TritionX-10030min，超纯水1000ml，含青链霉素的PBS溶液（100U/ml）12h。灌注液均以15ml/min的速度灌注，灌注过程中观察各时间点(0、30、60、120、180、240min等)肝脏颜色及形态的变化，以及HE、免疫组织化学染色检测肝脏脱细胞生物支架形态学改变。　　肝纤维化、肝硬化及其并发症威胁着全球居民的生命健康。虽然在过去的几十年中，人们为肝纤维化的防治工作进行了大量研究，在肝纤维化的发生机制方面已经取得了很大的进展，但在肝纤维化早期特异性诊断、准确分级以及有效的干预或逆转措施等方面并未取得实质性突破。　　理想的肝脏脱细胞技术能够完全去除肝内细胞成分及一些可溶性蛋白，保留了包含完整不溶性基质结构的生物支架，主要成分为纤维蛋白、层粘连蛋白等[8]，这些蛋白质通过空间构象，为肝脏实质细胞提供了生长发育的附着点，是维持肝脏正常结构与功能的组织基础。蛋白质组学方法为肝纤维化研究提供了先进的技术手段。MarcWilkins和KeithWilliams首次提出蛋白质组学(proteomics)[9]的概念，此后蛋白质组学成为继基因组计划完成后又一新兴生命科学前沿领域。目前蛋白质组学在医学上的应用主要包括差异蛋白质组学和功能蛋白质组学，前者主要是通过比较分析疾病组与正常人群或同一疾病不同发展时期在血清、组织、细胞乃至细胞器的蛋白质组，筛选出差异表达蛋白，并对其进行鉴定、定量及验证，寻找与疾病相关的新的标志物；而后者则侧重于对蛋白质的翻译后修饰等进行研究，探讨其生物学功能，二者均为探讨重大疾病的发病机制、疾病预防、早期诊断和治疗提供重要理论基础。　　因此，本研究将基于研究所的器官去细胞生物支架制备技术，利用蛋白质组学研究方法，通过双向电泳(2-DE)电泳、LC-MS/MS技术比较正常大鼠与CCl4诱导肝纤维化大鼠模型1周、2周、4周、6周和8周组去细胞生物支架蛋白质，成功诱导大鼠肝纤维化模型， Trypsin-Triton法制备正常及纤维化大鼠肝脏去细胞生物支架；筛选正常及纤维化大鼠肝脏去细胞生物支架的差异蛋白，利用western bloting技术及检测目的蛋白mRNA鉴定相应蛋白质，通过对模型形成过程大鼠肝脏生物支架蛋白质动态变化观察，为后续研究生物支架改变的目的基因调控，寻找诊断标准及制定合理的分级奠定实验基础　　本研究将基于课题组已成功制备正常大鼠肝脏去细胞生物支架基础上，通过蛋白质组学研究正常肝脏去细胞生物支架蛋白质组分，并结合肝纤维化动物模型，为深入探讨肝纤维化发病机制，寻找早期肝纤维化的诊断标志物，明确肝纤维化的合理分级及靶向肝脏生物支架改变的干预研究奠定实验基础。肝脏去细胞生物支架制备技术的出现为研究肝内结构型ECM的生物学效应提供了一个全新的技术平台，同时也为肝脏组织工程提供了一种全新的支架材料。项目负责人及成员通过生物支架制备技术对肝脏疾病的发病机制、肝脏再生等开展了系列研究。目前已经配备了制备器官去细胞生物支架所需的仪器设备，已成功掌握了DHB制备技术项目组已在国内一级期刊公开发表论文1篇，一篇SCI收录论文已被接受，另一篇国内一级杂志论文将在今年5月份见刊。具体如下：　　1.林刻智，林峰，郑双等，趋化因子CXC14在结直肠癌组织中的表达及其临床相关性研究，中国病理生理学杂志，30（2）：355-358。　　2.Ke-zhi Lin，Ruan-min Zhou，Feng Lin，et al.Expression and Effect of Chemokine CXCL14 in Colorectal Carcinoma，Molecular Medicine Reports.IF=1.17.已接受　　3.邵营宽，严夏霖，饶志恒，黄高建，李嘉威，黄俊杰，梅劲，林刻智*，大鼠胰腺去细胞天然支架生物相容性的鉴定，解剖学杂志.（通讯）.2014（8）

成果名称：	大鼠正常与纤维化肝脏生物支架的比较研究	关键词：	纤维化;去细胞;支架;ECM;2-DE
成果类别：		一级分类名称：	医学生物工程
二级分类名称：		三级分类名称：
研究起止时间：	2013.07 至2014.06	成果体现形式（应用技术类）：	无
成果属性：		成果体现形式（基础理论类）：
技术成熟度：		技术水平：
研究形式：		学科分类1：
单位名称：	温州医科大学	学科分类2：	320.24
中图分类号1：		所属高新技术类别：
中图分类号2：	R575.2	课题来源：
应用行业：		课题立项名称：
国家科技计划子类别：		课题立项编号：	Y20132798
经费实际投入额（万元）：	1.00	评价单位：	浙江省教育厅
评价形式：	无	应用状态：	无
评价日期：	2014.06.20	转让范围：
评价证书号：		推荐单位：	温州医科大学
推广形式：	无	成果登记号：	17024009
成果简介：	炎症损伤长期存在导致肝纤维化、肝硬化时，肝脏正常再生就会被抑制[4][5][6]，随着肝脏组织损伤加重，剩余正常部分肝功能失代偿时便导致肝功能衰竭。目前除肝移植外，尚无其他公认的治愈手段，但由于供体来源有限，需要终身服用免疫抑制剂，且治疗费用昂贵等限制了临床应用。肝脏组织工程学如生物人工肝、器官重构等研究领域的迅速发展为治疗肝功能衰竭提供了新路径，如何使去除实质细胞后的组织生物支架能够更好的、清晰的完整显示组织器官不溶性细胞外基质，最终能够血管化实现体内移植，是目前肝脏组织工程的核心研究内容和难点。　　本研究通过CCL4剂量个体化诱导大鼠肝纤维化模型（详见参考文献[13]），分别于模型诱导2周、4周、6周、8周取大鼠全肝标本，正常SD大鼠作为对照。AST和ALT检测及病理学检查，取部分肝脏组织用甲醛固定，观察肝组织病理改变。然后，取出部分肝脏，肝素PBS冲洗残留血液，至肝呈均一土黄色，进行分组，置于0.1%的Trypsin溶液中，恒温37℃，持续灌注（灌注压3.6mmHg）1-2h，超纯水1000ml，0.5%、1%SDS溶液1000ml12h（6h换液一次），或1%、3%TritionX-10030min，超纯水1000ml，含青链霉素的PBS溶液（100U/ml）12h。灌注液均以15ml/min的速度灌注，灌注过程中观察各时间点(0、30、60、120、180、240min等)肝脏颜色及形态的变化，以及HE、免疫组织化学染色检测肝脏脱细胞生物支架形态学改变。　　肝纤维化、肝硬化及其并发症威胁着全球居民的生命健康。虽然在过去的几十年中，人们为肝纤维化的防治工作进行了大量研究，在肝纤维化的发生机制方面已经取得了很大的进展，但在肝纤维化早期特异性诊断、准确分级以及有效的干预或逆转措施等方面并未取得实质性突破。　　理想的肝脏脱细胞技术能够完全去除肝内细胞成分及一些可溶性蛋白，保留了包含完整不溶性基质结构的生物支架，主要成分为纤维蛋白、层粘连蛋白等[8]，这些蛋白质通过空间构象，为肝脏实质细胞提供了生长发育的附着点，是维持肝脏正常结构与功能的组织基础。蛋白质组学方法为肝纤维化研究提供了先进的技术手段。MarcWilkins和KeithWilliams首次提出蛋白质组学(proteomics)[9]的概念，此后蛋白质组学成为继基因组计划完成后又一新兴生命科学前沿领域。目前蛋白质组学在医学上的应用主要包括差异蛋白质组学和功能蛋白质组学，前者主要是通过比较分析疾病组与正常人群或同一疾病不同发展时期在血清、组织、细胞乃至细胞器的蛋白质组，筛选出差异表达蛋白，并对其进行鉴定、定量及验证，寻找与疾病相关的新的标志物；而后者则侧重于对蛋白质的翻译后修饰等进行研究，探讨其生物学功能，二者均为探讨重大疾病的发病机制、疾病预防、早期诊断和治疗提供重要理论基础。　　因此，本研究将基于研究所的器官去细胞生物支架制备技术，利用蛋白质组学研究方法，通过双向电泳(2-DE)电泳、LC-MS/MS技术比较正常大鼠与CCl4诱导肝纤维化大鼠模型1周、2周、4周、6周和8周组去细胞生物支架蛋白质，成功诱导大鼠肝纤维化模型， Trypsin-Triton法制备正常及纤维化大鼠肝脏去细胞生物支架；筛选正常及纤维化大鼠肝脏去细胞生物支架的差异蛋白，利用western bloting技术及检测目的蛋白mRNA鉴定相应蛋白质，通过对模型形成过程大鼠肝脏生物支架蛋白质动态变化观察，为后续研究生物支架改变的目的基因调控，寻找诊断标准及制定合理的分级奠定实验基础　　本研究将基于课题组已成功制备正常大鼠肝脏去细胞生物支架基础上，通过蛋白质组学研究正常肝脏去细胞生物支架蛋白质组分，并结合肝纤维化动物模型，为深入探讨肝纤维化发病机制，寻找早期肝纤维化的诊断标志物，明确肝纤维化的合理分级及靶向肝脏生物支架改变的干预研究奠定实验基础。肝脏去细胞生物支架制备技术的出现为研究肝内结构型ECM的生物学效应提供了一个全新的技术平台，同时也为肝脏组织工程提供了一种全新的支架材料。项目负责人及成员通过生物支架制备技术对肝脏疾病的发病机制、肝脏再生等开展了系列研究。目前已经配备了制备器官去细胞生物支架所需的仪器设备，已成功掌握了DHB制备技术项目组已在国内一级期刊公开发表论文1篇，一篇SCI收录论文已被接受，另一篇国内一级杂志论文将在今年5月份见刊。具体如下：　　1.林刻智，林峰，郑双等，趋化因子CXC14在结直肠癌组织中的表达及其临床相关性研究，中国病理生理学杂志，30（2）：355-358。　　2.Ke-zhi Lin，Ruan-min Zhou，Feng Lin，et al.Expression and Effect of Chemokine CXCL14 in Colorectal Carcinoma，Molecular Medicine Reports.IF=1.17.已接受　　3.邵营宽，严夏霖，饶志恒，黄高建，李嘉威，黄俊杰，梅劲，林刻智*，大鼠胰腺去细胞天然支架生物相容性的鉴定，解剖学杂志.（通讯）.2014（8）
联系人：	秦园	成果登记日期：	2017-04-07
联系人email：		单位代码：	93309652
邮政编码222：	325035	联系人电话：
单位传真：	0577-86689912	单位通讯地址：	浙江省温州市茶山高教园区
单位所在省市：		单位电话：	0577-86699220
转让收入（万元）：	0	单位属性：
合作完成单位：		已转让企业数（个）：	0
成果发布年份：	2017	知识产权形式：
成果完成人：	林刻智;马建设;王志斌;梅劲;赵丽娜;余雅玲	资源采集日期：	2017-11-22

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