产琥珀酸放线杆菌关键限速酶酶分子改造及代谢流分析

成果基本信息
关键词：	丁二酸;放线杆菌;限速酶酶分子改造;代谢流分析
成果类别：		技术成熟度：
体现形式（基础理论类）：		体现形式（应用技术类）：	无
成果登记号：	201713393	资源采集日期：	2019-04-15

研究情况
单位名称：	广西科学院	技术水平：
评价证书号：		评价单位：	广西壮族自治区科学技术厅
评价日期：	2017.07.20	评价证书号：

转化情况
转让范围：		推广形式：	无
已转让企业数（个）：	0

联系方式
联系人（平台）：	玉女士	联系人（平台）电话：	0771-5885053
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成果简介
1.课题的来源与背景（1）课题来源本课题来源于广西自然基金课题“产琥珀酸放线杆菌关键限速酶酶分子改造及代谢流分析（2014GXNSFAA118102）”。（2）课题背景丁二酸作为一种重要的有机化工原料及中间体，可替代苯合成250种以上的化工产品，从而可大大减少苯的使用对环境的污染。主要用于医药、食品、化学工业以及分析试剂、食品铁质强化剂、照相和塑料材料工业等。目前，全球丁二酸的市场需求量在3万-5万吨/年，如果进一步降低成本将可能有超过400万吨的市场，市场前景巨大。传统的丁二酸主要是应用石化法从丁烷通过顺式丁烯二酐生产。优点是：工艺控制稳定、反应时间短、技术成熟度高；缺点是：以不可再生的石油资源为原料、污染大、成本、能耗高等，而且其在医药、食品、饲料等行业的应用受到限制，严重抑制了其发展潜力。而微生物发酵生物质原料生产丁二酸则可摆脱这一限制，具有更长远的意义。产琥珀酸放线杆菌是众多产丁二酸的微生物中最具工业化潜力的菌株之一，但是存在优良的高产菌株很难获得，发酵过程中丁二酸浓度低、副产物高、发酵成本高等问题，限制了微生物发酵生产丁二酸的发展。　　2.技术原理及性能指标（1）技术原理对前期筛选得到的丁二酸高产菌株进行代谢网络分析，针对产琥珀酸放线杆菌产丁二酸代谢过程中存在的关键限速步骤和关键限速酶问题，利用酶分子改造技术对关键限速酶基因进行非理性和理性酶分子改造，提高关键限速酶的酶活，解除丁二产生过程中限速步骤的制约；通发酵过程中pH、温度、H供体、氧化还原电位等生化反应途径调控研究关键酶的本征动力学，结合模型模拟、模型计算环境因素与关键酶的间接作用规律，发掘影响酶活力的外部因素，为丁二酸反应途径优化、生物质碳资源的高效利用提供指导。（2）性能指标将丁二酸代谢的关键限速酶基因（pepck）成功克隆至大肠杆菌并进行表达，并建立一套酶活测定方法；通过对关键酶分子非定向和定向改造，使改造后的酶分子活力提高20%以上，探索通过提高关键限速酶酶活，解除限速步骤，从而提高目标产物的微生物菌种选育方法；通过对获得工程菌株菌株进行发酵条件优化，使丁二酸产量达70 g/L 以上；发表相关学术论文3 篇，其中以第一作者发表国内核心论文1 篇，其他课题组成员发表2 篇，申请相关国家发明专利1 项；培养硕士生1名。　　3.技术的创造性与先进性本课题将pepck成功克隆至大肠杆菌并进行表达，并建立一套磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCK）酶活的测定方法；通过对关键酶分子进行易错PCK和定点突变和基因过量表达，获得工程菌株酶分子活力提高25%，解除了限速步骤的限制，丁二酸有一定的提高，建立了一套通过酶分子改造提高目标产物的微生物菌种选育方法；通过对获得工程菌株进行发酵条件优化，丁二酸产量最高达90 g/L 以上；以第1作者发表相关学术论文3篇，其中SCI论文3篇，申请相关国家发明专利5项；培养博士生1名，硕士生1名。目前有关产琥珀酸放线杆菌生产丁二酸的研究主要集中在菌株筛选及发酵条件优化方面，而通过关键限速酶及代谢工程改造的研究国内未见报道，因此，本项目处于国内领先水平。　　4.技术的成熟程度，适用范围和安全性目前，该项目的研究成果还处于实验室小试阶段，主要应用于微生物发酵产丁二酸生产，无安全问题。　　5.应用情况及存在的问题主要存在近几年石油价格持续走低，导致目前生物质能源及生物质材料产品无法与石油基产品竞争，随着石油价格上涨，及进一步选育高产菌株，降低丁二酸生产成本，经过进一步研发和放大研究，本项目将具有良好的经济效益和社会效益。　　6.历年获奖情况本项目尚未获得相关奖项。

成果名称：	产琥珀酸放线杆菌关键限速酶酶分子改造及代谢流分析	关键词：	丁二酸;放线杆菌;限速酶酶分子改造;代谢流分析
成果类别：		一级分类名称：	发酵工业
二级分类名称：		三级分类名称：
研究起止时间：	2014.06 至2017.05	成果体现形式（应用技术类）：	无
成果属性：		成果体现形式（基础理论类）：
技术成熟度：		技术水平：
研究形式：		学科分类1：
单位名称：	广西科学院	学科分类2：
中图分类号1：		所属高新技术类别：
中图分类号2：	TQ921	课题来源：
应用行业：		课题立项名称：
国家科技计划子类别：		课题立项编号：	2014GXNSFAA118102
经费实际投入额（万元）：	10.00	评价单位：	广西壮族自治区科学技术厅
评价形式：	无	应用状态：	无
评价日期：	2017.07.20	转让范围：
评价证书号：		推荐单位：	广西科学院
推广形式：	无	成果登记号：	201713393
成果简介：	1.课题的来源与背景（1）课题来源本课题来源于广西自然基金课题“产琥珀酸放线杆菌关键限速酶酶分子改造及代谢流分析（2014GXNSFAA118102）”。（2）课题背景丁二酸作为一种重要的有机化工原料及中间体，可替代苯合成250种以上的化工产品，从而可大大减少苯的使用对环境的污染。主要用于医药、食品、化学工业以及分析试剂、食品铁质强化剂、照相和塑料材料工业等。目前，全球丁二酸的市场需求量在3万-5万吨/年，如果进一步降低成本将可能有超过400万吨的市场，市场前景巨大。传统的丁二酸主要是应用石化法从丁烷通过顺式丁烯二酐生产。优点是：工艺控制稳定、反应时间短、技术成熟度高；缺点是：以不可再生的石油资源为原料、污染大、成本、能耗高等，而且其在医药、食品、饲料等行业的应用受到限制，严重抑制了其发展潜力。而微生物发酵生物质原料生产丁二酸则可摆脱这一限制，具有更长远的意义。产琥珀酸放线杆菌是众多产丁二酸的微生物中最具工业化潜力的菌株之一，但是存在优良的高产菌株很难获得，发酵过程中丁二酸浓度低、副产物高、发酵成本高等问题，限制了微生物发酵生产丁二酸的发展。　　2.技术原理及性能指标（1）技术原理对前期筛选得到的丁二酸高产菌株进行代谢网络分析，针对产琥珀酸放线杆菌产丁二酸代谢过程中存在的关键限速步骤和关键限速酶问题，利用酶分子改造技术对关键限速酶基因进行非理性和理性酶分子改造，提高关键限速酶的酶活，解除丁二产生过程中限速步骤的制约；通发酵过程中pH、温度、H供体、氧化还原电位等生化反应途径调控研究关键酶的本征动力学，结合模型模拟、模型计算环境因素与关键酶的间接作用规律，发掘影响酶活力的外部因素，为丁二酸反应途径优化、生物质碳资源的高效利用提供指导。（2）性能指标将丁二酸代谢的关键限速酶基因（pepck）成功克隆至大肠杆菌并进行表达，并建立一套酶活测定方法；通过对关键酶分子非定向和定向改造，使改造后的酶分子活力提高20%以上，探索通过提高关键限速酶酶活，解除限速步骤，从而提高目标产物的微生物菌种选育方法；通过对获得工程菌株菌株进行发酵条件优化，使丁二酸产量达70 g/L 以上；发表相关学术论文3 篇，其中以第一作者发表国内核心论文1 篇，其他课题组成员发表2 篇，申请相关国家发明专利1 项；培养硕士生1名。　　3.技术的创造性与先进性本课题将pepck成功克隆至大肠杆菌并进行表达，并建立一套磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCK）酶活的测定方法；通过对关键酶分子进行易错PCK和定点突变和基因过量表达，获得工程菌株酶分子活力提高25%，解除了限速步骤的限制，丁二酸有一定的提高，建立了一套通过酶分子改造提高目标产物的微生物菌种选育方法；通过对获得工程菌株进行发酵条件优化，丁二酸产量最高达90 g/L 以上；以第1作者发表相关学术论文3篇，其中SCI论文3篇，申请相关国家发明专利5项；培养博士生1名，硕士生1名。目前有关产琥珀酸放线杆菌生产丁二酸的研究主要集中在菌株筛选及发酵条件优化方面，而通过关键限速酶及代谢工程改造的研究国内未见报道，因此，本项目处于国内领先水平。　　4.技术的成熟程度，适用范围和安全性目前，该项目的研究成果还处于实验室小试阶段，主要应用于微生物发酵产丁二酸生产，无安全问题。　　5.应用情况及存在的问题主要存在近几年石油价格持续走低，导致目前生物质能源及生物质材料产品无法与石油基产品竞争，随着石油价格上涨，及进一步选育高产菌株，降低丁二酸生产成本，经过进一步研发和放大研究，本项目将具有良好的经济效益和社会效益。　　6.历年获奖情况本项目尚未获得相关奖项。
联系人：	何小英	成果登记日期：	2017-11-21
联系人email：		单位代码：	94500009
邮政编码222：	530022	联系人电话：	0771-2503961
单位传真：		单位通讯地址：	广西壮族自治区南宁市星湖路32号
单位所在省市：		单位电话：	0771-3212221;2536869
转让收入（万元）：	0	单位属性：
合作完成单位：		已转让企业数（个）：	0
成果发布年份：	2018	知识产权形式：
成果完成人：	申乃坤;廖思明;谢能中;王青艳;秦艳;朱婧;朱绮霞;米慧芝;刘海余	资源采集日期：	2019-04-15

产琥珀酸放线杆菌关键限速酶酶分子改造及代谢流分析

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