重组多肽蛋白药物高效生产关键技术

成果基本信息
关键词：	重组多肽蛋白药物;高效生产
成果类别：	应用技术	技术成熟度：	中期阶段
体现形式（基础理论类）：		体现形式（应用技术类）：	新技术
成果登记号：	藏科鉴字[2012]第08	资源采集日期：	2013-02-20

研究情况
单位名称：	西藏诺迪康药业股份有限公司	技术水平：	国内领先
评价证书号：	藏科鉴字[2012]第08号	评价单位：	西藏科技厅
评价日期：	2012.03.17	评价证书号：	藏科鉴字[2012]第08号

转化情况
转让范围：	不转让	推广形式：	技术服务
已转让企业数（个）：	0

联系方式
联系人（平台）：	玉女士	联系人（平台）电话：	0771-5885053
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成果简介
（1）任务来源　　本关键技术是基于西藏诺迪康药业股份有限公司、成都芝田生物工程有限公司、西华师范大学、四川恒星生物医药有限公司四方共建的产学研开发平台而形成的，研究任务来源于公司自选。　　（2）应用领域和技术原理　　本项目技术应用于医药领域，主要应用于具有药用价值的的低分子量多肽，对宿主菌株毒性较大的蛋白，稳定性较差的蛋白和容易被宿主蛋白酶降解的蛋白类药物的融合表达及规模化工业生产。　　技术原理：小分子多肽药物是由20-100个氨基酸组成的多肽，如用于急性心衰治疗的人脑利钠肽（rhBNP），为32个氨基酸残基组成的具有内环的多肽；用于II型糖尿病治疗的胰高血糖素样肽-1受体激动剂（Exendin-4），由39个氨基酸残基组成的。这类多肽由于其分子量较小，无法使用常规的基因重组方法进行构建、表达、分离纯化。目前国内外针对该类多肽多采用化学合成方法，但存在生产工艺复杂、反应难控制、生产成本高、有环境污染（大量使用有机溶剂）等弊端。另外还有一些蛋白质药物，如人角质细胞生长因子（KGF-1），这类蛋白对大肠杆菌等常用宿主细菌具有很强毒性，无法在宿主内高效表达，据国内外文献报道rhKGF-1蛋白的表达量仅为全菌蛋白的1%-2%，这使得其按常规原核表达技术来实现规模化生产的可能性几乎为零。　　本项目从多肽蛋白类药物基因结构、蛋白结构与功能关系出发，设计一系列特异性高效表达的融合表达载体如pGEX 、pDTa等，并在特异表达的蛋白前加入融合伴侣，如GST、DAB，构建了高效表达目标融合蛋白的宿主菌株；以包涵体形式表达的融合蛋白，则利用独特的复性技术提高其复性得率；所有的融合蛋白，我们均利用特异性酶切技术如高纯度的Enterkinase、Xa因子、凝血酶、肠激酶、凝乳酶、胶原酶等，切掉融合伴侣，从而获得与天然蛋白结构与功能完全一致的目标多肽或蛋白质，实现有价值的目标小分子多肽和低表达、高毒性蛋白质的规模化工业生产，使之应用于临床。　　1. 高效融合表达基因工程菌的构建　　本关键技术从低表达的小分子多肽和蛋白的基因结构、蛋白结构与功能关系出发，创造性的运用蛋白质融合表达技术，设计具有对目的蛋白的表达和纯化效率具有显著提高的融合蛋白，从根本上提高低表达的小分子多肽和有毒性的蛋白表达效率。使其可用作工业化规模生产。　　针对仅有20-100氨基酸的难表达且不易定量检测的小分子多肽，设计并构建了pTDa作为融合表达载体，该载体的转录启动能力比LacUV5启动子强5倍，从而为小分子多肽药物如rhBNP等融合蛋白的高效表达提供了前提条件。同时还创造性地在目的基因末端加上融合伴侣如硫氧还蛋白（Thioredoxin），硫氧还蛋白融合伴侣本身的分子量不大，因而间接提高了小分子目的多肽在整个表达中所占的比例，更为重要的是其本身是质子供体，在因融合蛋白高效表达而形成包涵体的情况下，在包涵体的复性过程中，融合伴侣能够协助融合蛋白正常折叠，从而将极大的提高复性效率，使工艺得到简化。　　另外，一些使用常规基因工程手段表达量极低的小分子多肽，目前主要通过化学合成的手段大规模生产，由于其化学合成过程中需要使用有机溶剂，极易造成环境和安全性问题。针对此种多肽，本项目创造性的设计了pET-DsbA改构体。该载体表达的DsbA融合蛋白是具有协助二硫键形成的重要分子内伴侣。本项目通过对DsbA做突变处理，去掉其信号肽基因，同时将其氧化还原功能相关的两个半胱氨酸（Cys）突变成丝氨酸（Ser），从而实现目标多肽的可溶性表达，避免复杂的复性工艺。　　对于一些人源化蛋白，如重组人角质细胞生长因子（rhKGF-1），其本身对宿主细菌具有较大毒性，因此表达量仅有1%-2%，无法实现规模化生产。本项目采用pET-GST载体表达系统。其中pET系统是有史以来在大肠杆菌中表达重组蛋白功能最强大的系统，较为适于表达毒性蛋白，可有效减少因目的蛋白的本底表达对宿主细胞生长和质粒稳定性的影响，有利于提高目的蛋白的表达量。同时我们还添加了分子伴侣GST作为表达rhKGF-1的融合标签。首先GST标签可解决非融合表达时，蛋白的mRNA因在翻译起始阶段形成茎环结构而降低表达量的问题；其次可利用GST增加蛋白表达和促进蛋白正确折叠的特性，提高稳定型蛋白改构体的表达量和溶解性，有利于进行大规模的发酵生产；第三GST的空间屏蔽作用会遮蔽rhKGF-1发挥毒性作用的活性位点，减弱其“毒蛋白”作用。最终本项目获得rhKGF-1融合蛋白改构体表达量达20%以上。从根本上该类蛋白的稳定、高效表达，顺利实现规模化生产。　　2. 融合蛋白的特异性切割　　在融合蛋白表达体构建中，我们创造性的在融合蛋白基因上加入特异性的酶切位点，如高纯度的凝血酶、或者Enterkinase即EK酶等酶切位点，利用特异性酶切技术，切掉融合伴侣，从得到与天然结构完全一致的目标多肽或蛋白质。　　3. 高稳定性目标蛋白的分离纯化　　重组蛋白都要经过多种不同层析介质的纯化才能获得高纯度的目的蛋白。本项目构建带有融合标签的融合蛋白，这使其纯化方法变得简单易行，通常只需1-2种亲和层析介质就可达到纯化目的蛋白的目的。如融合蛋白GST-目标蛋白改构体在N端带有His融合标签，使用组氨酸亲和胶(Ni-NTA Resin)，只需一步亲和层析即可获得纯化的目的蛋白，纯化工艺更加简便快捷，可有效降低生产成本。　　（3）性能指标　　本公司首先从rhBNP、Exendin-4、rhKGF-1、rhPTH（1-34）等现有技术表达量低，无法通过常规技术实现规模化大生产的小分子多肽及蛋白出发，创造性的运用融合蛋白表达技术，通过构建不同的融合蛋白形成新型改构体，从而获得高效表达的工程菌株；利用特异性酶切技术实现融合伴侣与目的蛋白的分离，获得了与天然结构完全一致的目标蛋白，并实现了规模化生产的应用，使得这四个品种成为了具有自主知识产权的上市及即将上市的产品，为小分子多肽及毒性较大的蛋白类药物规模化生产提供的新的思路，有效的促进了我区生物技术药物的进步，也缩短了我国生物技术药物规模化生产方面与国外的差距，极大的造福了广大患者。现将对采用本项目融合表达关键技术获得的产品BNP、Exendin4、KGF-1及PTH性能指标作如下阐述：　　1. 重组人脑利钠肽（rhBNP）　　rhBNP为小分子多肽药物，分子量仅3464 Da，由于分子量较小，用常规基因工程技术难以表达，而利用本项目融合蛋白表达技术获得的rhBNP纯品得率300mg/L发酵液；半成品纯度大于95%（RP—HPLC分析）以上，N-末端测定、分子量质谱测定、等电点测定、氨基酸组成测定、生物活性测定与人体天然BNP完全一致，rhBNP成品活性、安全性、热源、稳定性、无菌检测完全合格。　　2005年获得国家新药证书和生产批件，2007年还被国家发改委认定为“国家高技术产业化示范工程”，目前年销售额达1.2亿元左右。　　2. 重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂（rExendin-4）　　rExendin-4为39个氨基酸残基组成，据国内外文献报道其无法表达，现有上市品种为化学合成，而本项目产品rExendin-4纯品得率为每升发酵液20mg，半成品纯度大于95%（RP-HPLC分析）以上，等电点测定、氨基酸组成测定、生物学活性测定等理化性质和生物学特性与文献报道完全一致。rExendin-4成品活性、安全性、热源、稳定性、无菌检测完全合格，其药理学各项指标与理论值完全一致，且与化学合成产品具有相同的理化性质和生物学活性。该产品的临床前研究和临床试验均获得了十一五国家重大新药创制重大专项资助，现已获得国家一类新药临床批件，并已成功转让给国内龙头制药企业—石药集团。　　3. 重组人角质细胞生长因子-1（rhKGF-1）　　由于KGF-1对宿主细菌毒性较大，国内外文献报道表达均为1-2%的表达，根本无法实现工业化生产。本项目通过融合表达技术，rhKGF-1表达效率可达全菌蛋白的20%左右，产量提高10多倍，分离得到的纯品可达每升发酵液50mg。其理化性质、生物学活性与人体天然KGF一致。该产品成为十一五国家重大新药创制重大专项资助品种，现已经完成临床前研究的全部资料，率先获得临床受理通知书，正在等待SFDA颁发临床受理批件。　　4. 重组人甲状旁腺素（1-34）[rhPTH（(1-34）)] 　　rhPTH（1-34）是目前国内开发的首家唯一一种开发目前唯一促进骨形成的药物，它与人体内天然的人甲状旁腺素(1-84)的C--端的第1-34个氨基酸具有相同的氨基酸序列，并且二者具有相同的生物学活性和生理、药理学特征，是采用基因重组技术获得的小分子多肽药物。经连续三批中试生产结果表明，本项目各批次产品基本一致，完全达到了本项目检定规程所规定的各项指标，根据《中国新生物制品检定规程》要求，我们生产的hPTH半成品纯度大于95％(RP—HPLC分析)以上，N—末端测定、分子量质谱测定、等电点测定、氨基酸组成测定与人体内自然分泌的PTH(Parathyroid Hormone)的N-端部分完全一致，rhPTH成品活性、安全性、热源、稳定性、无菌检测完全合格。结果表明其生物活性测定及药理学各项指标与国外产品文献报道结果基本一致。目前，本产品已获得SFDA颁发的临床批件（批件号：2003L01454），并进入II期临床研究阶段。　　（4）与国外同类技术比较　　融合表达使外源基因连接到融合蛋白的C-端，不必另外设计SD序列，同时N-端的存在使得外源基因的表达较容易；同时因为外源基因的表达产物常被宿主细胞的蛋白酶降解，当外源基因与宿主本身蛋白的部分序列构成融合基因的形式表达时，会减低宿主细胞对产物的降解。因此国内外学者常将融合蛋白技术用于蛋白的表达方面。　　但国内外的研究仅停留在对单一品种的研究，且形成融合蛋白表达后多形成包涵体，需要通过变性、复性、纯化等复杂手段才能获得目的蛋白。就目前国内外的研究情况来看，目的蛋白的复性至今没有通用的有效方法，使得利用融合蛋白表达技术无法推广应用到不同类型的目的蛋白。无法解决基因工程药物表达量低，目的蛋白稳定性差、纯品得率低、生产成本高以及工业化大生产困难等问题，严重的制约了当今基因工程药物的发展。　　本项目研发团队通过构建特异系列表达载体，筛选一系列具有不同功能的融合蛋白标签，能最大限度的满足不同种类的目的蛋白如分子量较低的多肽类，对宿主菌株毒性较大的蛋白类，稳定性较差的蛋白类，容易被宿主蛋白酶降的蛋白类等目的蛋白的融合表达，获得高表达菌株，然后通过设计特异酶切技术，获得具有生物活性、折叠正确的可溶性目的蛋白；同时简化纯化步骤，获得产率和纯度较高的目的蛋白，形成了较为成熟的技术平台和关键技术，能被广泛的用于开发不同种类，特别是小分子及对宿主具有显著毒性和低表达重组多肽及蛋白类药物。　　本研究团队应用融合表达技术成功的的研制出rhBNP、rhKGF-1 、rhExendin-4等系列产品，与国内外同类产品相比也具有明显的优势，具体如下：　　一、重组人脑利钠肽（rhBNP）　　1. 创新融合表达：与硫氧还蛋白融合表达，融合伴侣促进BNP环状活性结构自动回复。　　2. 特异性定点切割：将rhBNP与融合伴侣完整，准确切割，获得与人体BNP完全一致的结构和功能。　　3. 高载量低压反相纯化技术：创造性采用低压反相层析技术，纯化效率高、载量高；为小肽药物的制备提供新的方法和手段。　　4. 本产品具有自主知识产权，目前该产品唯一竞争品种为美国强生的Natrecor，本产品与Natrecor先进性对比如下：　　A 生产方式：本品为基因重组药物，而Natrecor最初为化学合成，之后改为基因重组。　　B 理化性质、生物学活性：与Natrecor完全一致。　　C售价：本品为人民币1480元/支，Natrecor为380美元/支。　　二、重组人甲状旁腺素（1-34）[rhPTH（1-34）] 　　1. 高效表达载体构建；构建适合表达的独特表达系统pDTa，使hPTH（1-34）融合表达产物在随后复性过程中能形成正确的空间结构。　　2. 创新融合表达：与硫氧还蛋白融合表达，从而实现包涵体融合蛋白量在高浓度状态下稀释复性，复性率达90%以上。　　3. 特异性定点切割：将rhPTH（1-34）与融合伴侣完整，准确切割，获得与天然PTH（1-34）完全一致的结构和功能。　　4. 高载量低压反相纯化技术：创造性采用低压反相层析技术，纯化效率高、载量高；为小肽药物的制备提供新的方法和手段。　　5. 目前该产品唯一竞争品种为美国礼莱公司的Forteo，本产品与Forteo理化性质及生物学活性均完全一致。　　三、重组人角质细胞生长因子（rhKGF）　　1. 本项目中GST-KGF1融合蛋白以可溶的形式存在（以肠激酶Enterkinase识别序列连接），从而大大简化生产工艺和大大提高生产效率。　　2. 通过上述工艺得到的KGF1，其结构等理化特性和生物学活性与文献报道的结构完全一致，避免通常重组蛋白药物N-端前面多出一个Met甚至多个氨基酸残基，从而可降低其免疫原性。　　3. 理化性质及生物活性：与Amgen公司上市产品Kepivance完全一致。　　四、重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂（rExendin-4）　　美国Amylin公司上市的Exendin-4为化学合成制备的多肽，本研究团队所研究开发的重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂（rExendin-4）的氨基酸序列与其完全相同，但是本研究团队的胰高血糖素样肽-1受体激动剂（rExendin-4）是通过基因重组技术，建立大肠杆菌融合表达体系生产制备的，采用了完全不同的制备手段和工艺途径。相比化学合成的多肽，本产品生产成本大大降低，对规模化生产的技术要求也大大减小，并避免了大量使用化学试剂带来的大量污染。　　本研究团队制备的rExendin-4与国外Sigma公司采用化学合成方法制备的Exendin-4进行了体外生物学活性的比较研究，发现二者的体外生物学活性基本一致。同时制备的rExendin-4药理学研究也表明给予Exendin-4使血糖值降低到了接近正常值的水平。且发现Exendin-4还能够刺激胰岛β-细胞复制和再生以及抑制胰岛β-细胞的调亡。这种功能也许在将来可能被证明在糖尿病治疗中是非常有用的。　　现所完成的临床前药理毒理研究结果表明：采用基因工程建立的多肽融合表达技术制备的重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂对各种实验动物模型具有显著的刺激胰岛素分泌作用和血糖控制作用，以及抑制食欲、胃排空速率和降低体重的作用，与国外合成的样品具有相同的体内生物学特性。在相关的毒性试验研究中，也没有发现特别需要关注的毒副作用或严重的不良反应。　　（5）成果的知识产权情况　　针对该关键技术及项目产品，本团队已申请了八项发明专利，其中已有两项专利获得了国家发明专利权，分别是ZL200410062650.5，名称为酰胺化Exendin-4多肽的重组制备方法，ZL200510085496.8，名称为一种重组人角质细胞生长因子的生产方法，使得该关键技术下的产品成为了拥有自主知识产权的特有品种。　　总之，本研究团队构建的融合蛋白表达系统充分体现了先进性、成熟性和稳定性。利用这一技术，填补中国小分子多肽药物开发空白，为多肽小分子药物研究开发建立起了一个通用技术平台。　　（6）成果的创造性、先进性　　本项目利用融合基因构建技术、酶切技术、复性及纯化技术等建立了一套高效的、规模化的融合蛋白表达技术，成功的运用于小分子及低表达量的重组多肽及蛋白的规模化生产，取得了具有五年市场独占权的一类新药rhBNP的新药证书和生产批件；获得一类新药rh Exendin-4的临床批件并实现技术成果转让（已经转让给石药集团）；获得rhPTH的临床批件，正在进行II期临床研究；获得rhKGF-1的新药临床受理通知书等。现对该系列实现的产品rhBNP 、rhExendin4、rhKGF-1、rhPTH的创造性、先进性作如下阐述：　　1. rhBNP是我国生物制品一类新药，是我国第一个用于急性心衰治疗的生物医药制品。其分子量仅为3464 Da，是上市产品中最小的肽之一。这也是目前基因工程产品规模化生产过程中的难题之一，经过对该项目长期的工业化规模生产工艺研究，采用硫氧还蛋白作为融合伴侣，获得了高效表达基因工程菌，同时有效的确保了rhBNP分子内的正确环化，完全形成正确的二级空间结构，克服了小分子多肽药物表达量过低的缺陷。本项目产品生产工艺简单可行，产品的生产成本也大大降低，目前，我们已就该工艺有关关键技术申请了国家发明专利。该产品创新性具体论述如下：　　①创新性使用硫氧还蛋白作为融合伴侣，从而实现rhBNP分子内的正确环化，完全形成正确的二级空间结构；　　②创新性的使用超滤收集系统收集rhBNP工程菌，从而大大缩短生产时间和节约能耗；　　③rhBNP纯品得率300mg/L发酵液，明显优于同类产品。　　④rhBNP已率先获得国家食品药品监督管理局颁发的新药证书(证书编号：国药证字S20050033)及生产批文，并获得五年新药独占权，2011年实现营业收入6800余万元。　　⑤rhBNP经全国12家参试医院的专家和学者自已在试验中的心得体会以及各医院分报告的系统总结，认为该药物具有非常优秀的疗效和安全性特性，是目前治疗急性心力衰竭中，安全性最好的药物，该药物还填补了我国在治疗心衰领域的一个空白。该产品的研究达到了与国际同类品种一致的先进水平，显示出良好的应用推广前景。　　⑥rhBNP申请多项专利，建立了从基因构建到产品发酵纯化及冻干最终制剂等三项发明专利及多项外观设计，构建该品种的专利壁垒，更为有效的保护的该品种的市场价值。　　2. Exendin-4为生物制品一类新药，该产品是一种39肽，与南美洲大毒蜥的唾液中分泌出的活性多肽（Exendin-4）有相同的氨基酸序列，本研究团队利用自己的创新技术和手段，首创重组酰胺化Exendin4，该产品创新性具体论述如下：　　①目前，已上市的Exendin-4为化学合成产品，本项目产品主要采用大肠杆菌为生物载体的基因重组技术，按照大肠杆菌密码偏好性原则优化编码基因，rExendin 4编码基因与突变DsbA融合，形成DsbA-E4改构体从而获得高表达菌株，使得最总纯品得率达到20mg/L。　　②建立了高效简捷的目标多肽纯化工艺，利用Enterkinase切割融合蛋白，分离纯化Enterkinase-4Gly利用，用a-酰胺化酶将Enterkinase-4Gly转化为酰胺化Exendin-4，分离纯化酰胺化Exendin-4。　　③rExendin-4纯品得率为50mg/L发酵液，明显优于国内外同类产品。　　④该产品就上述创新性技术申请并获得授权，中国发明专利名称：酰胺化Exendin-4多肽的重组制备方法，专利号：ZL200410062650.5。　　⑤本公司对酰胺化重组Exendin4进行了系统的临床药学、药效学、急性毒性、长期毒性等安全性评价指标进行研究。本产品已经完成临床前研究的全部资料，并获得新药临床批件CXSL 0700007。　　3. rhKGF是利用基因重组技术规模化生产重组人角质细胞生长因子变构体，该产品创新性具体论述如下：　　①由于rhKGF对大肠杆菌毒性极大，国内外普遍rhKGF的表达水平极低（只有全菌蛋白的1%～2%）。本课题首先从KGF的基因结构、蛋白结构与功能关系出发，设计并筛选稳定的冻干重组人角质细胞生长因子冻干制剂序列，考虑到rhKGF对宿主细菌的毒性，创造性的构建了GST-KGF改构体融合表达体系，利用GST的空间屏蔽作用遮蔽重组KGF发挥毒性作用的活性位点而减弱其“毒蛋白”作用，获得表达量达20%以上的GST-KGF改构体高效表达工程菌株，实现稳定型KGF-1的高效可溶表达。　　②rhKGF在生产及保存过程中容易发生去折叠和聚集沉淀而造成活性降低，使rhKGF稳定性差，严重制约rhKGF临床开发应用，本项目通过研究各种条件（发酵温度、pH、溶氧等）对菌体生长密度和GST-KGF改构体表达水平的影响；研究各种因素（包括菌体破碎条件、层析条件和酶切条件等）对目的蛋白的分离纯化效率、回收率和纯度的影响，获得高效表达的高密度发酵中试工艺和一步亲和层析即可获得纯化的目的蛋白纯化工艺，有效降低生产成本。　　③rhKGF表达效率可达全菌蛋白的20%左右，产量提高20倍左右，纯品纯品得率为50mg/L发酵液，显著优于国内外同类产品。　　④该产品就创新性表达生产rhKGF申请并获得授权，中国发明专利名称为一种重组人角质细胞生长因子的生产方法， ZL200510085496.8。　　⑤本公司对该产品进行了系统的临床药学、药效学、急性毒性、长期毒性等安全性评价指标进行研究。该产品现已经完成临床前研究的全部资料，率先在国内申请临床研究并获得国家食品药品监督管理局的受理通知书（受理号：CXSL1000008川）。　　4. rhPTH是利用基因工程技术，将编码人类PTH基因的cDNA碱基序列进行改造，再克隆到适合的大肠杆菌质粒中，经严格筛选，获得高效表达的基因工程菌株；建立稳定高效且适用于规模化生产的后处理纯化工艺，获得二级结构正确，其产品创新性作如下论述：　　①利用基因重组技术对编码的hPTH（1-34）肽的DNA序列进行优化，适用于大肠杆菌高效转录和翻译。从面获得高效表达基因工程菌，其目标融合蛋白含量占全菌量的30%以上。　　②选择了高效表达并利于表达产物复性的表达系统；构建适合表达的独特表达系统PDTa,使hPTH（1-34）融合表达产物在随后复性过程中使hPTH（1-34）能形成正确的空间结构。　　③创造性地将hPTH与Thoredoxin融合表达，从而实现包涵体融合蛋白量在高浓度状态下稀释复性，复性率达90%以上。　　④创新性试验低压反相层析技术，具有纯化效率高，载量高的特点　　⑤hPTH具有特殊的环状二级结构，通过本工艺生产制造的hPTH与天然的hPTH理化性质完全一致。　　⑥具有得率高的特点，一升发酵液可得纯品50毫克，为国内小分子多肽产量较高的药品之一，故生产成本较低。　　⑦现已获得获得国家食品药品监督管理局颁发的新药临床批件2003L01454，并进入II期临床研究阶段。

成果名称：	重组多肽蛋白药物高效生产关键技术	关键词：	重组多肽蛋白药物;高效生产
成果类别：	应用技术	一级分类名称：	生物制药
二级分类名称：		三级分类名称：
研究起止时间：	1999.08 至2012.01	成果体现形式（应用技术类）：	新技术
成果属性：	原始性创新	成果体现形式（基础理论类）：
技术成熟度：	中期阶段	技术水平：	国内领先
研究形式：	与院校、所合作	学科分类1：	国家标准GB T13745-92《学科分类与代码》
单位名称：	西藏诺迪康药业股份有限公司	学科分类2：
中图分类号1：	中国图书资料分类法（第四版）	所属高新技术类别：	生物、医药和医疗器械
中图分类号2：		课题来源：	国家科技计划
应用行业：	制造业	课题立项名称：
国家科技计划子类别：	其他	课题立项编号：	藏科鉴字[2012]第08号
经费实际投入额（万元）：	1060.00	评价单位：	西藏科技厅
评价形式：	鉴定	应用状态：	小批量或小范围应用
评价日期：	2012.03.17	转让范围：	不转让
评价证书号：	藏科鉴字[2012]第08号	推荐单位：
推广形式：	技术服务	成果登记号：	藏科鉴字[2012]第08
成果简介：	（1）任务来源　　本关键技术是基于西藏诺迪康药业股份有限公司、成都芝田生物工程有限公司、西华师范大学、四川恒星生物医药有限公司四方共建的产学研开发平台而形成的，研究任务来源于公司自选。　　（2）应用领域和技术原理　　本项目技术应用于医药领域，主要应用于具有药用价值的的低分子量多肽，对宿主菌株毒性较大的蛋白，稳定性较差的蛋白和容易被宿主蛋白酶降解的蛋白类药物的融合表达及规模化工业生产。　　技术原理：小分子多肽药物是由20-100个氨基酸组成的多肽，如用于急性心衰治疗的人脑利钠肽（rhBNP），为32个氨基酸残基组成的具有内环的多肽；用于II型糖尿病治疗的胰高血糖素样肽-1受体激动剂（Exendin-4），由39个氨基酸残基组成的。这类多肽由于其分子量较小，无法使用常规的基因重组方法进行构建、表达、分离纯化。目前国内外针对该类多肽多采用化学合成方法，但存在生产工艺复杂、反应难控制、生产成本高、有环境污染（大量使用有机溶剂）等弊端。另外还有一些蛋白质药物，如人角质细胞生长因子（KGF-1），这类蛋白对大肠杆菌等常用宿主细菌具有很强毒性，无法在宿主内高效表达，据国内外文献报道rhKGF-1蛋白的表达量仅为全菌蛋白的1%-2%，这使得其按常规原核表达技术来实现规模化生产的可能性几乎为零。　　本项目从多肽蛋白类药物基因结构、蛋白结构与功能关系出发，设计一系列特异性高效表达的融合表达载体如pGEX 、pDTa等，并在特异表达的蛋白前加入融合伴侣，如GST、DAB，构建了高效表达目标融合蛋白的宿主菌株；以包涵体形式表达的融合蛋白，则利用独特的复性技术提高其复性得率；所有的融合蛋白，我们均利用特异性酶切技术如高纯度的Enterkinase、Xa因子、凝血酶、肠激酶、凝乳酶、胶原酶等，切掉融合伴侣，从而获得与天然蛋白结构与功能完全一致的目标多肽或蛋白质，实现有价值的目标小分子多肽和低表达、高毒性蛋白质的规模化工业生产，使之应用于临床。　　1. 高效融合表达基因工程菌的构建　　本关键技术从低表达的小分子多肽和蛋白的基因结构、蛋白结构与功能关系出发，创造性的运用蛋白质融合表达技术，设计具有对目的蛋白的表达和纯化效率具有显著提高的融合蛋白，从根本上提高低表达的小分子多肽和有毒性的蛋白表达效率。使其可用作工业化规模生产。　　针对仅有20-100氨基酸的难表达且不易定量检测的小分子多肽，设计并构建了pTDa作为融合表达载体，该载体的转录启动能力比LacUV5启动子强5倍，从而为小分子多肽药物如rhBNP等融合蛋白的高效表达提供了前提条件。同时还创造性地在目的基因末端加上融合伴侣如硫氧还蛋白（Thioredoxin），硫氧还蛋白融合伴侣本身的分子量不大，因而间接提高了小分子目的多肽在整个表达中所占的比例，更为重要的是其本身是质子供体，在因融合蛋白高效表达而形成包涵体的情况下，在包涵体的复性过程中，融合伴侣能够协助融合蛋白正常折叠，从而将极大的提高复性效率，使工艺得到简化。　　另外，一些使用常规基因工程手段表达量极低的小分子多肽，目前主要通过化学合成的手段大规模生产，由于其化学合成过程中需要使用有机溶剂，极易造成环境和安全性问题。针对此种多肽，本项目创造性的设计了pET-DsbA改构体。该载体表达的DsbA融合蛋白是具有协助二硫键形成的重要分子内伴侣。本项目通过对DsbA做突变处理，去掉其信号肽基因，同时将其氧化还原功能相关的两个半胱氨酸（Cys）突变成丝氨酸（Ser），从而实现目标多肽的可溶性表达，避免复杂的复性工艺。　　对于一些人源化蛋白，如重组人角质细胞生长因子（rhKGF-1），其本身对宿主细菌具有较大毒性，因此表达量仅有1%-2%，无法实现规模化生产。本项目采用pET-GST载体表达系统。其中pET系统是有史以来在大肠杆菌中表达重组蛋白功能最强大的系统，较为适于表达毒性蛋白，可有效减少因目的蛋白的本底表达对宿主细胞生长和质粒稳定性的影响，有利于提高目的蛋白的表达量。同时我们还添加了分子伴侣GST作为表达rhKGF-1的融合标签。首先GST标签可解决非融合表达时，蛋白的mRNA因在翻译起始阶段形成茎环结构而降低表达量的问题；其次可利用GST增加蛋白表达和促进蛋白正确折叠的特性，提高稳定型蛋白改构体的表达量和溶解性，有利于进行大规模的发酵生产；第三GST的空间屏蔽作用会遮蔽rhKGF-1发挥毒性作用的活性位点，减弱其“毒蛋白”作用。最终本项目获得rhKGF-1融合蛋白改构体表达量达20%以上。从根本上该类蛋白的稳定、高效表达，顺利实现规模化生产。　　2. 融合蛋白的特异性切割　　在融合蛋白表达体构建中，我们创造性的在融合蛋白基因上加入特异性的酶切位点，如高纯度的凝血酶、或者Enterkinase即EK酶等酶切位点，利用特异性酶切技术，切掉融合伴侣，从得到与天然结构完全一致的目标多肽或蛋白质。　　3. 高稳定性目标蛋白的分离纯化　　重组蛋白都要经过多种不同层析介质的纯化才能获得高纯度的目的蛋白。本项目构建带有融合标签的融合蛋白，这使其纯化方法变得简单易行，通常只需1-2种亲和层析介质就可达到纯化目的蛋白的目的。如融合蛋白GST-目标蛋白改构体在N端带有His融合标签，使用组氨酸亲和胶(Ni-NTA Resin)，只需一步亲和层析即可获得纯化的目的蛋白，纯化工艺更加简便快捷，可有效降低生产成本。　　（3）性能指标　　本公司首先从rhBNP、Exendin-4、rhKGF-1、rhPTH（1-34）等现有技术表达量低，无法通过常规技术实现规模化大生产的小分子多肽及蛋白出发，创造性的运用融合蛋白表达技术，通过构建不同的融合蛋白形成新型改构体，从而获得高效表达的工程菌株；利用特异性酶切技术实现融合伴侣与目的蛋白的分离，获得了与天然结构完全一致的目标蛋白，并实现了规模化生产的应用，使得这四个品种成为了具有自主知识产权的上市及即将上市的产品，为小分子多肽及毒性较大的蛋白类药物规模化生产提供的新的思路，有效的促进了我区生物技术药物的进步，也缩短了我国生物技术药物规模化生产方面与国外的差距，极大的造福了广大患者。现将对采用本项目融合表达关键技术获得的产品BNP、Exendin4、KGF-1及PTH性能指标作如下阐述：　　1. 重组人脑利钠肽（rhBNP）　　rhBNP为小分子多肽药物，分子量仅3464 Da，由于分子量较小，用常规基因工程技术难以表达，而利用本项目融合蛋白表达技术获得的rhBNP纯品得率300mg/L发酵液；半成品纯度大于95%（RP—HPLC分析）以上，N-末端测定、分子量质谱测定、等电点测定、氨基酸组成测定、生物活性测定与人体天然BNP完全一致，rhBNP成品活性、安全性、热源、稳定性、无菌检测完全合格。　　2005年获得国家新药证书和生产批件，2007年还被国家发改委认定为“国家高技术产业化示范工程”，目前年销售额达1.2亿元左右。　　2. 重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂（rExendin-4）　　rExendin-4为39个氨基酸残基组成，据国内外文献报道其无法表达，现有上市品种为化学合成，而本项目产品rExendin-4纯品得率为每升发酵液20mg，半成品纯度大于95%（RP-HPLC分析）以上，等电点测定、氨基酸组成测定、生物学活性测定等理化性质和生物学特性与文献报道完全一致。rExendin-4成品活性、安全性、热源、稳定性、无菌检测完全合格，其药理学各项指标与理论值完全一致，且与化学合成产品具有相同的理化性质和生物学活性。该产品的临床前研究和临床试验均获得了十一五国家重大新药创制重大专项资助，现已获得国家一类新药临床批件，并已成功转让给国内龙头制药企业—石药集团。　　3. 重组人角质细胞生长因子-1（rhKGF-1）　　由于KGF-1对宿主细菌毒性较大，国内外文献报道表达均为1-2%的表达，根本无法实现工业化生产。本项目通过融合表达技术，rhKGF-1表达效率可达全菌蛋白的20%左右，产量提高10多倍，分离得到的纯品可达每升发酵液50mg。其理化性质、生物学活性与人体天然KGF一致。该产品成为十一五国家重大新药创制重大专项资助品种，现已经完成临床前研究的全部资料，率先获得临床受理通知书，正在等待SFDA颁发临床受理批件。　　4. 重组人甲状旁腺素（1-34）[rhPTH（(1-34）)] 　　rhPTH（1-34）是目前国内开发的首家唯一一种开发目前唯一促进骨形成的药物，它与人体内天然的人甲状旁腺素(1-84)的C--端的第1-34个氨基酸具有相同的氨基酸序列，并且二者具有相同的生物学活性和生理、药理学特征，是采用基因重组技术获得的小分子多肽药物。经连续三批中试生产结果表明，本项目各批次产品基本一致，完全达到了本项目检定规程所规定的各项指标，根据《中国新生物制品检定规程》要求，我们生产的hPTH半成品纯度大于95％(RP—HPLC分析)以上，N—末端测定、分子量质谱测定、等电点测定、氨基酸组成测定与人体内自然分泌的PTH(Parathyroid Hormone)的N-端部分完全一致，rhPTH成品活性、安全性、热源、稳定性、无菌检测完全合格。结果表明其生物活性测定及药理学各项指标与国外产品文献报道结果基本一致。目前，本产品已获得SFDA颁发的临床批件（批件号：2003L01454），并进入II期临床研究阶段。　　（4）与国外同类技术比较　　融合表达使外源基因连接到融合蛋白的C-端，不必另外设计SD序列，同时N-端的存在使得外源基因的表达较容易；同时因为外源基因的表达产物常被宿主细胞的蛋白酶降解，当外源基因与宿主本身蛋白的部分序列构成融合基因的形式表达时，会减低宿主细胞对产物的降解。因此国内外学者常将融合蛋白技术用于蛋白的表达方面。　　但国内外的研究仅停留在对单一品种的研究，且形成融合蛋白表达后多形成包涵体，需要通过变性、复性、纯化等复杂手段才能获得目的蛋白。就目前国内外的研究情况来看，目的蛋白的复性至今没有通用的有效方法，使得利用融合蛋白表达技术无法推广应用到不同类型的目的蛋白。无法解决基因工程药物表达量低，目的蛋白稳定性差、纯品得率低、生产成本高以及工业化大生产困难等问题，严重的制约了当今基因工程药物的发展。　　本项目研发团队通过构建特异系列表达载体，筛选一系列具有不同功能的融合蛋白标签，能最大限度的满足不同种类的目的蛋白如分子量较低的多肽类，对宿主菌株毒性较大的蛋白类，稳定性较差的蛋白类，容易被宿主蛋白酶降的蛋白类等目的蛋白的融合表达，获得高表达菌株，然后通过设计特异酶切技术，获得具有生物活性、折叠正确的可溶性目的蛋白；同时简化纯化步骤，获得产率和纯度较高的目的蛋白，形成了较为成熟的技术平台和关键技术，能被广泛的用于开发不同种类，特别是小分子及对宿主具有显著毒性和低表达重组多肽及蛋白类药物。　　本研究团队应用融合表达技术成功的的研制出rhBNP、rhKGF-1 、rhExendin-4等系列产品，与国内外同类产品相比也具有明显的优势，具体如下：　　一、重组人脑利钠肽（rhBNP）　　1. 创新融合表达：与硫氧还蛋白融合表达，融合伴侣促进BNP环状活性结构自动回复。　　2. 特异性定点切割：将rhBNP与融合伴侣完整，准确切割，获得与人体BNP完全一致的结构和功能。　　3. 高载量低压反相纯化技术：创造性采用低压反相层析技术，纯化效率高、载量高；为小肽药物的制备提供新的方法和手段。　　4. 本产品具有自主知识产权，目前该产品唯一竞争品种为美国强生的Natrecor，本产品与Natrecor先进性对比如下：　　A 生产方式：本品为基因重组药物，而Natrecor最初为化学合成，之后改为基因重组。　　B 理化性质、生物学活性：与Natrecor完全一致。　　C售价：本品为人民币1480元/支，Natrecor为380美元/支。　　二、重组人甲状旁腺素（1-34）[rhPTH（1-34）] 　　1. 高效表达载体构建；构建适合表达的独特表达系统pDTa，使hPTH（1-34）融合表达产物在随后复性过程中能形成正确的空间结构。　　2. 创新融合表达：与硫氧还蛋白融合表达，从而实现包涵体融合蛋白量在高浓度状态下稀释复性，复性率达90%以上。　　3. 特异性定点切割：将rhPTH（1-34）与融合伴侣完整，准确切割，获得与天然PTH（1-34）完全一致的结构和功能。　　4. 高载量低压反相纯化技术：创造性采用低压反相层析技术，纯化效率高、载量高；为小肽药物的制备提供新的方法和手段。　　5. 目前该产品唯一竞争品种为美国礼莱公司的Forteo，本产品与Forteo理化性质及生物学活性均完全一致。　　三、重组人角质细胞生长因子（rhKGF）　　1. 本项目中GST-KGF1融合蛋白以可溶的形式存在（以肠激酶Enterkinase识别序列连接），从而大大简化生产工艺和大大提高生产效率。　　2. 通过上述工艺得到的KGF1，其结构等理化特性和生物学活性与文献报道的结构完全一致，避免通常重组蛋白药物N-端前面多出一个Met甚至多个氨基酸残基，从而可降低其免疫原性。　　3. 理化性质及生物活性：与Amgen公司上市产品Kepivance完全一致。　　四、重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂（rExendin-4）　　美国Amylin公司上市的Exendin-4为化学合成制备的多肽，本研究团队所研究开发的重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂（rExendin-4）的氨基酸序列与其完全相同，但是本研究团队的胰高血糖素样肽-1受体激动剂（rExendin-4）是通过基因重组技术，建立大肠杆菌融合表达体系生产制备的，采用了完全不同的制备手段和工艺途径。相比化学合成的多肽，本产品生产成本大大降低，对规模化生产的技术要求也大大减小，并避免了大量使用化学试剂带来的大量污染。　　本研究团队制备的rExendin-4与国外Sigma公司采用化学合成方法制备的Exendin-4进行了体外生物学活性的比较研究，发现二者的体外生物学活性基本一致。同时制备的rExendin-4药理学研究也表明给予Exendin-4使血糖值降低到了接近正常值的水平。且发现Exendin-4还能够刺激胰岛β-细胞复制和再生以及抑制胰岛β-细胞的调亡。这种功能也许在将来可能被证明在糖尿病治疗中是非常有用的。　　现所完成的临床前药理毒理研究结果表明：采用基因工程建立的多肽融合表达技术制备的重组胰高血糖素样肽-1受体激动剂对各种实验动物模型具有显著的刺激胰岛素分泌作用和血糖控制作用，以及抑制食欲、胃排空速率和降低体重的作用，与国外合成的样品具有相同的体内生物学特性。在相关的毒性试验研究中，也没有发现特别需要关注的毒副作用或严重的不良反应。　　（5）成果的知识产权情况　　针对该关键技术及项目产品，本团队已申请了八项发明专利，其中已有两项专利获得了国家发明专利权，分别是ZL200410062650.5，名称为酰胺化Exendin-4多肽的重组制备方法，ZL200510085496.8，名称为一种重组人角质细胞生长因子的生产方法，使得该关键技术下的产品成为了拥有自主知识产权的特有品种。　　总之，本研究团队构建的融合蛋白表达系统充分体现了先进性、成熟性和稳定性。利用这一技术，填补中国小分子多肽药物开发空白，为多肽小分子药物研究开发建立起了一个通用技术平台。　　（6）成果的创造性、先进性　　本项目利用融合基因构建技术、酶切技术、复性及纯化技术等建立了一套高效的、规模化的融合蛋白表达技术，成功的运用于小分子及低表达量的重组多肽及蛋白的规模化生产，取得了具有五年市场独占权的一类新药rhBNP的新药证书和生产批件；获得一类新药rh Exendin-4的临床批件并实现技术成果转让（已经转让给石药集团）；获得rhPTH的临床批件，正在进行II期临床研究；获得rhKGF-1的新药临床受理通知书等。现对该系列实现的产品rhBNP 、rhExendin4、rhKGF-1、rhPTH的创造性、先进性作如下阐述：　　1. rhBNP是我国生物制品一类新药，是我国第一个用于急性心衰治疗的生物医药制品。其分子量仅为3464 Da，是上市产品中最小的肽之一。这也是目前基因工程产品规模化生产过程中的难题之一，经过对该项目长期的工业化规模生产工艺研究，采用硫氧还蛋白作为融合伴侣，获得了高效表达基因工程菌，同时有效的确保了rhBNP分子内的正确环化，完全形成正确的二级空间结构，克服了小分子多肽药物表达量过低的缺陷。本项目产品生产工艺简单可行，产品的生产成本也大大降低，目前，我们已就该工艺有关关键技术申请了国家发明专利。该产品创新性具体论述如下：　　①创新性使用硫氧还蛋白作为融合伴侣，从而实现rhBNP分子内的正确环化，完全形成正确的二级空间结构；　　②创新性的使用超滤收集系统收集rhBNP工程菌，从而大大缩短生产时间和节约能耗；　　③rhBNP纯品得率300mg/L发酵液，明显优于同类产品。　　④rhBNP已率先获得国家食品药品监督管理局颁发的新药证书(证书编号：国药证字S20050033)及生产批文，并获得五年新药独占权，2011年实现营业收入6800余万元。　　⑤rhBNP经全国12家参试医院的专家和学者自已在试验中的心得体会以及各医院分报告的系统总结，认为该药物具有非常优秀的疗效和安全性特性，是目前治疗急性心力衰竭中，安全性最好的药物，该药物还填补了我国在治疗心衰领域的一个空白。该产品的研究达到了与国际同类品种一致的先进水平，显示出良好的应用推广前景。　　⑥rhBNP申请多项专利，建立了从基因构建到产品发酵纯化及冻干最终制剂等三项发明专利及多项外观设计，构建该品种的专利壁垒，更为有效的保护的该品种的市场价值。　　2. Exendin-4为生物制品一类新药，该产品是一种39肽，与南美洲大毒蜥的唾液中分泌出的活性多肽（Exendin-4）有相同的氨基酸序列，本研究团队利用自己的创新技术和手段，首创重组酰胺化Exendin4，该产品创新性具体论述如下：　　①目前，已上市的Exendin-4为化学合成产品，本项目产品主要采用大肠杆菌为生物载体的基因重组技术，按照大肠杆菌密码偏好性原则优化编码基因，rExendin 4编码基因与突变DsbA融合，形成DsbA-E4改构体从而获得高表达菌株，使得最总纯品得率达到20mg/L。　　②建立了高效简捷的目标多肽纯化工艺，利用Enterkinase切割融合蛋白，分离纯化Enterkinase-4Gly利用，用a-酰胺化酶将Enterkinase-4Gly转化为酰胺化Exendin-4，分离纯化酰胺化Exendin-4。　　③rExendin-4纯品得率为50mg/L发酵液，明显优于国内外同类产品。　　④该产品就上述创新性技术申请并获得授权，中国发明专利名称：酰胺化Exendin-4多肽的重组制备方法，专利号：ZL200410062650.5。　　⑤本公司对酰胺化重组Exendin4进行了系统的临床药学、药效学、急性毒性、长期毒性等安全性评价指标进行研究。本产品已经完成临床前研究的全部资料，并获得新药临床批件CXSL 0700007。　　3. rhKGF是利用基因重组技术规模化生产重组人角质细胞生长因子变构体，该产品创新性具体论述如下：　　①由于rhKGF对大肠杆菌毒性极大，国内外普遍rhKGF的表达水平极低（只有全菌蛋白的1%～2%）。本课题首先从KGF的基因结构、蛋白结构与功能关系出发，设计并筛选稳定的冻干重组人角质细胞生长因子冻干制剂序列，考虑到rhKGF对宿主细菌的毒性，创造性的构建了GST-KGF改构体融合表达体系，利用GST的空间屏蔽作用遮蔽重组KGF发挥毒性作用的活性位点而减弱其“毒蛋白”作用，获得表达量达20%以上的GST-KGF改构体高效表达工程菌株，实现稳定型KGF-1的高效可溶表达。　　②rhKGF在生产及保存过程中容易发生去折叠和聚集沉淀而造成活性降低，使rhKGF稳定性差，严重制约rhKGF临床开发应用，本项目通过研究各种条件（发酵温度、pH、溶氧等）对菌体生长密度和GST-KGF改构体表达水平的影响；研究各种因素（包括菌体破碎条件、层析条件和酶切条件等）对目的蛋白的分离纯化效率、回收率和纯度的影响，获得高效表达的高密度发酵中试工艺和一步亲和层析即可获得纯化的目的蛋白纯化工艺，有效降低生产成本。　　③rhKGF表达效率可达全菌蛋白的20%左右，产量提高20倍左右，纯品纯品得率为50mg/L发酵液，显著优于国内外同类产品。　　④该产品就创新性表达生产rhKGF申请并获得授权，中国发明专利名称为一种重组人角质细胞生长因子的生产方法， ZL200510085496.8。　　⑤本公司对该产品进行了系统的临床药学、药效学、急性毒性、长期毒性等安全性评价指标进行研究。该产品现已经完成临床前研究的全部资料，率先在国内申请临床研究并获得国家食品药品监督管理局的受理通知书（受理号：CXSL1000008川）。　　4. rhPTH是利用基因工程技术，将编码人类PTH基因的cDNA碱基序列进行改造，再克隆到适合的大肠杆菌质粒中，经严格筛选，获得高效表达的基因工程菌株；建立稳定高效且适用于规模化生产的后处理纯化工艺，获得二级结构正确，其产品创新性作如下论述：　　①利用基因重组技术对编码的hPTH（1-34）肽的DNA序列进行优化，适用于大肠杆菌高效转录和翻译。从面获得高效表达基因工程菌，其目标融合蛋白含量占全菌量的30%以上。　　②选择了高效表达并利于表达产物复性的表达系统；构建适合表达的独特表达系统PDTa,使hPTH（1-34）融合表达产物在随后复性过程中使hPTH（1-34）能形成正确的空间结构。　　③创造性地将hPTH与Thoredoxin融合表达，从而实现包涵体融合蛋白量在高浓度状态下稀释复性，复性率达90%以上。　　④创新性试验低压反相层析技术，具有纯化效率高，载量高的特点　　⑤hPTH具有特殊的环状二级结构，通过本工艺生产制造的hPTH与天然的hPTH理化性质完全一致。　　⑥具有得率高的特点，一升发酵液可得纯品50毫克，为国内小分子多肽产量较高的药品之一，故生产成本较低。　　⑦现已获得获得国家食品药品监督管理局颁发的新药临床批件2003L01454，并进入II期临床研究阶段。
联系人：	马宏川	成果登记日期：	2012-03-17
联系人email：		单位代码：	95400125
邮政编码222：	850000	联系人电话：	13989987896
单位传真：	0891-6837749	单位通讯地址：	西藏自治区拉萨市北京中路9号科技厅院内
单位所在省市：	西藏自治区	单位电话：	0891-6839608;6835809
转让收入（万元）：	0	单位属性：	企业
合作完成单位：	成都芝田生物工程有限公司;西华师范大学;四川恒星生物医药有限公司	已转让企业数（个）：	0
成果发布年份：	2012	知识产权形式：
成果完成人：	陈达杉;彭红卫;董兆勇;黎云翔;周材权;赵斌;杨伟;任东升;张宝华;赵波;何晨;王建州	资源采集日期：	2013-02-20

重组多肽蛋白药物高效生产关键技术

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