利用农副产物发酵纳豆激酶及工业化高效分离提取技术研究

成果基本信息
关键词：	纳豆激酶;发酵;提取
成果类别：	应用技术	技术成熟度：	成熟应用阶段
体现形式（基础理论类）：		体现形式（应用技术类）：	新工艺
成果登记号：	9232012Y1403	资源采集日期：	2013-02-20

研究情况
单位名称：	黑龙江八一农垦大学	技术水平：	国内先进
评价证书号：	黑科垦鉴字[2012]第18号	评价单位：	黑龙江省农垦总局
评价日期：	2012.07.07	评价证书号：	黑科垦鉴字[2012]第18号

转化情况
转让范围：	限国内转让	推广形式：	合作开发、技术服务
已转让企业数（个）：	1

联系方式
联系人（平台）：	孵化基地	联系人（平台）电话：	0771-3394012
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成果简介
1、纳豆激酶高产菌株的筛选鉴定及其特性研究结果从五种纳豆及豆豉样品中分离得到30株具有溶纤酶活性的菌株，通过酪蛋白平板初筛筛选得到5株菌株，对这5株菌株进行个体形态，菌落形态及其生理生化鉴定，确认其均属于枯草芽孢杆菌属。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和纳豆激酶活性测定进行两次复筛，筛选出1株纳豆激酶高产菌株T-3，酶活性可以达到3158.97IU/mL，菌株T-3对温度、pH、胆盐的耐受性及对某些菌株的抑制能力较好，并且具有良好的传代稳定性。 2、纳豆激酶高产菌株的培养条件优化结果以OD600为评价指标，T-3为生产菌株，首先进行不同的温度、pH值、装液量、接种量、摇床转数、种龄、碳源、氮源、碳氮源浓度、金属离子的单因素实验，确定的适宜培养条件为：温度37℃，pH6.0，接种量3%，装液量1/5，培养时间9h，摇床转数180rpm。以单因素确定的培养基组成结果作为二次旋转正交实验的零水平，优化出该菌株的适宜培养基组成为：葡萄糖3%，大豆蛋白胨2%，硫酸镁0.2%，硫酸氢二钾0.1%，磷酸二氢钾0.2%，氯化钙0.03%。在优化条件下菌株的最大生长量可达2.780，较优化前提高了0.914。 3、纳豆激酶高产菌株的发酵工艺研究结果以纳豆激酶活性为指标，T-3为生产菌株，首先进行不同温度、pH、接种量、装液量、摇床转数、种龄、碳源、氮源、碳氮源浓度、表面活性剂、金属离子、诱导物的单因素实验，确定适宜的产酶条件为：温度37℃，pH7.0，接种量3%，装液量1/5，摇床转数180rpm，培养时间14h。以单因素确定的培养基组成结果作为二次旋转正交实验的零水平，确定了该菌株的优化产酶培养基组成为：可溶性淀粉4%，豆粕粉2%，酪蛋白0.4%，羧甲基纤维素0.6%，磷酸氢二钾0.4%，磷酸二氢钾0.4%，氯化钙0.02%。在最适条件下发酵，发酵液的纳豆激酶活性在第3d达到最大值，酶活性为5835.28IU/mL，较优化前提高了3154.04IU/mL。 4、超声波辅助盐析提取纳豆激酶的研究结果以纳豆菌发酵液为原料，利用低强度超声波辅助提取技术，对纳豆菌发酵液中的纳豆激酶进行提取研究。在单因素试验的基础上，由二次回归正交旋转组合试验来优化超声辅助单级盐析时的最佳盐析条件。结果表明：不同超声频率、不同超声处理时间、不同超声声强等均对纳豆激酶在盐析过程中的回收有影响；最终得到超声处理的优化工艺条件为：超声频率20 kHz，处理时间3 min，超声后无静置，在此条件下，纳豆激酶的回收率可达到97.59%。 5、超滤法提取纳豆激酶的研究结果以实验室制备的纳豆激酶粗酶液为原料，研究了超滤系统中超滤压力、超滤温度、料液pH值主要参数对膜通量的影响，确定了超滤分离纳豆激酶的最佳工艺条件：最佳超滤压力为0.25 Mp、料液温度为37℃、料液pH为7；可得到比活力为9610.46 IU/mg、纯化倍数为2.36、回收率为92.3%的酶液，酶液经HPD-400树脂洗脱得到单一蛋白峰，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，表现为单一蛋白条带，相对分子质量约为28000D左右。采用超滤技术对纳豆激酶进行分离提纯，可提高酶活性及回收率，技术参数可行。 6、模拟移动床分离纯化纳豆激酶的研究结果利用模拟移动床从纳豆激酶发酵液中分离纯化纳豆激酶，通过单柱试验计算出模拟移动床的分区方式及初始参数，利用正交试验方法优化参数，最终所得纳豆激酶的纯度为90 %、收率为85 %、活性为8000±50 IU/mg。

成果名称：	利用农副产物发酵纳豆激酶及工业化高效分离提取技术研究	关键词：	纳豆激酶;发酵;提取
成果类别：	应用技术	一级分类名称：	生物制药
二级分类名称：		三级分类名称：
研究起止时间：	2007.09 至2012.07	成果体现形式（应用技术类）：	新工艺
成果属性：	原始性创新	成果体现形式（基础理论类）：
技术成熟度：	成熟应用阶段	技术水平：	国内先进
研究形式：	独立研究	学科分类1：	国家标准GB T13745-92《学科分类与代码》
单位名称：	黑龙江八一农垦大学	学科分类2：
中图分类号1：	中国图书资料分类法（第四版）	所属高新技术类别：
中图分类号2：		课题来源：	地方计划
应用行业：	制造业	课题立项名称：
国家科技计划子类别：		课题立项编号：	HNKXIV-06-05a
经费实际投入额（万元）：	6.00	评价单位：	黑龙江省农垦总局
评价形式：	鉴定	应用状态：	稳定应用
评价日期：	2012.07.07	转让范围：	限国内转让
评价证书号：	黑科垦鉴字[2012]第18号	推荐单位：	黑龙江省农垦总局
推广形式：	合作开发、技术服务	成果登记号：	9232012Y1403
成果简介：	1、纳豆激酶高产菌株的筛选鉴定及其特性研究结果从五种纳豆及豆豉样品中分离得到30株具有溶纤酶活性的菌株，通过酪蛋白平板初筛筛选得到5株菌株，对这5株菌株进行个体形态，菌落形态及其生理生化鉴定，确认其均属于枯草芽孢杆菌属。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和纳豆激酶活性测定进行两次复筛，筛选出1株纳豆激酶高产菌株T-3，酶活性可以达到3158.97IU/mL，菌株T-3对温度、pH、胆盐的耐受性及对某些菌株的抑制能力较好，并且具有良好的传代稳定性。 2、纳豆激酶高产菌株的培养条件优化结果以OD600为评价指标，T-3为生产菌株，首先进行不同的温度、pH值、装液量、接种量、摇床转数、种龄、碳源、氮源、碳氮源浓度、金属离子的单因素实验，确定的适宜培养条件为：温度37℃，pH6.0，接种量3%，装液量1/5，培养时间9h，摇床转数180rpm。以单因素确定的培养基组成结果作为二次旋转正交实验的零水平，优化出该菌株的适宜培养基组成为：葡萄糖3%，大豆蛋白胨2%，硫酸镁0.2%，硫酸氢二钾0.1%，磷酸二氢钾0.2%，氯化钙0.03%。在优化条件下菌株的最大生长量可达2.780，较优化前提高了0.914。 3、纳豆激酶高产菌株的发酵工艺研究结果以纳豆激酶活性为指标，T-3为生产菌株，首先进行不同温度、pH、接种量、装液量、摇床转数、种龄、碳源、氮源、碳氮源浓度、表面活性剂、金属离子、诱导物的单因素实验，确定适宜的产酶条件为：温度37℃，pH7.0，接种量3%，装液量1/5，摇床转数180rpm，培养时间14h。以单因素确定的培养基组成结果作为二次旋转正交实验的零水平，确定了该菌株的优化产酶培养基组成为：可溶性淀粉4%，豆粕粉2%，酪蛋白0.4%，羧甲基纤维素0.6%，磷酸氢二钾0.4%，磷酸二氢钾0.4%，氯化钙0.02%。在最适条件下发酵，发酵液的纳豆激酶活性在第3d达到最大值，酶活性为5835.28IU/mL，较优化前提高了3154.04IU/mL。 4、超声波辅助盐析提取纳豆激酶的研究结果以纳豆菌发酵液为原料，利用低强度超声波辅助提取技术，对纳豆菌发酵液中的纳豆激酶进行提取研究。在单因素试验的基础上，由二次回归正交旋转组合试验来优化超声辅助单级盐析时的最佳盐析条件。结果表明：不同超声频率、不同超声处理时间、不同超声声强等均对纳豆激酶在盐析过程中的回收有影响；最终得到超声处理的优化工艺条件为：超声频率20 kHz，处理时间3 min，超声后无静置，在此条件下，纳豆激酶的回收率可达到97.59%。 5、超滤法提取纳豆激酶的研究结果以实验室制备的纳豆激酶粗酶液为原料，研究了超滤系统中超滤压力、超滤温度、料液pH值主要参数对膜通量的影响，确定了超滤分离纳豆激酶的最佳工艺条件：最佳超滤压力为0.25 Mp、料液温度为37℃、料液pH为7；可得到比活力为9610.46 IU/mg、纯化倍数为2.36、回收率为92.3%的酶液，酶液经HPD-400树脂洗脱得到单一蛋白峰，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，表现为单一蛋白条带，相对分子质量约为28000D左右。采用超滤技术对纳豆激酶进行分离提纯，可提高酶活性及回收率，技术参数可行。 6、模拟移动床分离纯化纳豆激酶的研究结果利用模拟移动床从纳豆激酶发酵液中分离纯化纳豆激酶，通过单柱试验计算出模拟移动床的分区方式及初始参数，利用正交试验方法优化参数，最终所得纳豆激酶的纯度为90 %、收率为85 %、活性为8000±50 IU/mg。
联系人：	食品学院	成果登记日期：	2012-10-31
联系人email：		单位代码：	92300070
邮政编码222：	163319	联系人电话：	0459-6819235
单位传真：	0459-6819126	单位通讯地址：	黑龙江省大庆市高新区
单位所在省市：	黑龙江省	单位电话：	0459-6819126;6819390
转让收入（万元）：	0	单位属性：	大专院校
合作完成单位：		已转让企业数（个）：	1
成果发布年份：	2012	知识产权形式：
成果完成人：	刘妍妍;张丽萍;郭希娟;王宪青;曹荣安;王欣;张显明;陈景鑫;沙维	资源采集日期：	2013-02-20

利用农副产物发酵纳豆激酶及工业化高效分离提取技术研究

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