本研究以金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc)为靶基因，选择特异性引物，进行PCR扩增，检测乳品中的金黄色葡萄球菌。对PCR反应体系中镁离子浓度、模板量及退火温度和循环数进行优化，以确定适宜PCR反应体系和PCR扩增程序，其适宜反应体系为：5ml 10XPCR buffer(200mM Tris-HCl[pH8.3]，500mM KCl，15mm MgCl2，0.1﹪[wt/vol] gelatin，0.5﹪Tween 20)，4ml dNTPs混合物，0.5ml 40mmol正向引物，0.5ml 40mmol反向引物，0.25ml（5U·ml-1）Taq，模板2ml，水37.75ml，总反应体系50ml；其适宜PCR扩增程序为：PCR反应采用冷启动，94℃预变性4min，再按94℃1min～52℃0.5min～72℃1.5min进行35个循环，最后72℃延伸3.5min。PCR反应产物在2﹪的琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像系统观察结果。对PCR扩增产物进行了DNA测序，PCR扩增产物DNA序列与靶基因序列的同源性达99.6﹪，从而证实PCR扩增产物确为目的扩增产物。采用PCR方法共检测了60株金黄色葡萄球菌和20株其他革兰氏阳性菌和阴性菌，结果表明60株金黄色葡萄球菌中60株均为阳性结果；20株其它菌株均为阴性结果，因此本研究选择的引物特异性强。PCR方法的灵敏度为0.675pg。 　　本研究对乳品中金黄色葡萄球菌DNA的6种提取方法进行了比较，确定了一种可有效从乳品中提取金黄色葡萄球菌DNA的方法。该方法无需对样品进行增菌，可直接从乳品中提取金黄色葡萄球菌DNA，作为模板进行PCR检测，检测效果良好。采用该方法成功地从人工污染金黄色葡萄球菌的全脂乳、脱脂乳和奶酪中提取了金黄色葡萄球菌的DNA，消除了PCR反应抑制因子。这种直接从乳品中检测金黄色葡萄球菌的PCR方法灵敏度高，耗时短，全脂乳和脱脂乳检测的灵敏度为10cfu·ml-1，奶酪检测的灵敏度为55cfu·g-1，可在6h内完成对乳品中金黄色葡萄球菌的检测，比目前普遍采用的先增菌再进行PCR检测的方法缩短了12～24h。 　　本研究所采用的PCR检测乳品中金黄色葡萄球菌方法与国标GB 4789.10-2003方法及两种快速检测致病性金黄色葡萄球菌测试片做了比较，结果表明：PCR方法的敏感性为100﹪，特异性为86.7﹪，符合率为94.3﹪，检测时间为6h；petrfilm RSA方法的敏感性为100﹪，特异性为93.3﹪，符合率为97.1﹪，检测时间为30h；Baird-Parker R.P.F方法的敏感性为100﹪，特异性为93.3﹪，符合率为97.1﹪，检测时间为30h。三种方法的敏感性相同，PCR方法的特异性低于其他两种方法，PCR方法的符合率稍低于其他两种方法，但PCR方法检测时间比其他两种方法缩短了24h。 　　本项目针对金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因，选择特异引物，建立了快速检测食品中金黄色葡萄球菌的PCR方法。大大缩短了金黄色葡萄球菌的检测时间，提高了检测方法的灵敏性，为金黄色葡萄球菌引起的食源性疾病的快速诊断提供了技术支持。项目成果具有极其广阔的推广和应用前景。

　　本研究以金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc)为靶基因，选择特异性引物，进行PCR扩增，检测乳品中的金黄色葡萄球菌。对PCR反应体系中镁离子浓度、模板量及退火温度和循环数进行优化，以确定适宜PCR反应体系和PCR扩增程序，其适宜反应体系为：5ml 10XPCR buffer(200mM Tris-HCl[pH8.3]，500mM KCl，15mm MgCl2，0.1﹪[wt/vol] gelatin，0.5﹪Tween 20)，4ml dNTPs混合物，0.5ml 40mmol正向引物，0.5ml 40mmol反向引物，0.25ml（5U·ml-1）Taq，模板2ml，水37.75ml，总反应体系50ml；其适宜PCR扩增程序为：PCR反应采用冷启动，94℃预变性4min，再按94℃1min～52℃0.5min～72℃1.5min进行35个循环，最后72℃延伸3.5min。PCR反应产物在2﹪的琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像系统观察结果。对PCR扩增产物进行了DNA测序，PCR扩增产物DNA序列与靶基因序列的同源性达99.6﹪，从而证实PCR扩增产物确为目的扩增产物。采用PCR方法共检测了60株金黄色葡萄球菌和20株其他革兰氏阳性菌和阴性菌，结果表明60株金黄色葡萄球菌中60株均为阳性结果；20株其它菌株均为阴性结果，因此本研究选择的引物特异性强。PCR方法的灵敏度为0.675pg。 　　本研究对乳品中金黄色葡萄球菌DNA的6种提取方法进行了比较，确定了一种可有效从乳品中提取金黄色葡萄球菌DNA的方法。该方法无需对样品进行增菌，可直接从乳品中提取金黄色葡萄球菌DNA，作为模板进行PCR检测，检测效果良好。采用该方法成功地从人工污染金黄色葡萄球菌的全脂乳、脱脂乳和奶酪中提取了金黄色葡萄球菌的DNA，消除了PCR反应抑制因子。这种直接从乳品中检测金黄色葡萄球菌的PCR方法灵敏度高，耗时短，全脂乳和脱脂乳检测的灵敏度为10cfu·ml-1，奶酪检测的灵敏度为55cfu·g-1，可在6h内完成对乳品中金黄色葡萄球菌的检测，比目前普遍采用的先增菌再进行PCR检测的方法缩短了12～24h。 　　本研究所采用的PCR检测乳品中金黄色葡萄球菌方法与国标GB 4789.10-2003方法及两种快速检测致病性金黄色葡萄球菌测试片做了比较，结果表明：PCR方法的敏感性为100﹪，特异性为86.7﹪，符合率为94.3﹪，检测时间为6h；petrfilm RSA方法的敏感性为100﹪，特异性为93.3﹪，符合率为97.1﹪，检测时间为30h；Baird-Parker R.P.F方法的敏感性为100﹪，特异性为93.3﹪，符合率为97.1﹪，检测时间为30h。三种方法的敏感性相同，PCR方法的特异性低于其他两种方法，PCR方法的符合率稍低于其他两种方法，但PCR方法检测时间比其他两种方法缩短了24h。 　　本项目针对金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因，选择特异引物，建立了快速检测食品中金黄色葡萄球菌的PCR方法。大大缩短了金黄色葡萄球菌的检测时间，提高了检测方法的灵敏性，为金黄色葡萄球菌引起的食源性疾病的快速诊断提供了技术支持。项目成果具有极其广阔的推广和应用前景。