一、简要技术说明 　　1、研究背景及应用领域 　　近年来，随着分子生物学与细胞遗传学的发展，骨髓染色体核型分析在血液系统疾病的诊断、治疗和预后中发挥了越来越重要的作用，在骨髓染色体显带技术中，R显带技术对揭示涉及染色体末端缺失和易位更具价值，制备出带纹清晰、易于识别的染色体是辨认微小结构异常的前提，而在影响骨髓细胞染色体R显带技术的诸多因素中，显带时间与显带液的pH对显带效果的影响较为明显，但两者对显带效果的确切影响及其关系在文献中少有论及，本研究旨通过在达到最佳显带效果时，分析两因素的相互关系，探索更佳的显带条件，培育出清晰、易于观察的R带染色体，为染色体形态异常的观察提供支持。 　　2、目的 　　探讨骨髓细胞染色体制备过程中R显带技术的影响因素，分析显带液的pH值和显带时间的相关性。 　　3、技术路线 　　3.1主要仪器及试剂 　　超净工作台、恒温培养箱、通风橱、冰箱、低温冰柜、恒温水浴箱、显微镜、立式染缸、酒精灯、水平离心机、小牛血清、RPMI1640培养瓶、谷氨酰胺、秋水仙胺、甲醇、冰醋酸、Giemsa染液、NaCl、KCl、MgSO4、CaCl2、KH2PO4、Na2HPO4、酚红、枸橼酸钠、葡萄糖等。 　　3.2实验对象 　　收集自2007年6月至2008年1月在我院就诊的门诊及住院血液病患者的骨髓液2～4ml，共278例，年龄3～78岁，良性血液病患者80例（再生障碍性贫血12例，巨幼细胞性贫血25例，溶血性贫血7例，缺铁性贫血27例，及血小板减少性紫癜9例），恶性血液病患者198例（急性粒细胞白血病75例，骨髓增生异常综合征52例，慢性粒细胞性白血病31例，急性淋巴细胞白血病29例，淋巴细胞增殖性疾病11例）。所有病例均经细胞形态学、组织细胞化学确诊，恶性血液病根据MICM分型分类。 　　3.3实验方法 　　3.3.1采集的骨髓标本经接种、骨髓短期培养后收获、制片。 　　3.3.2显带 　　分别配置pH值为5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6～6.7的显带液，分别放入50ml上述显带液于不同的立式染缸中，每缸加入葡萄糖50mg，加盖后置于预定温度87.5℃的恒温水浴箱中加温，当温度升至87.5℃，立即将上述制备好的玻片以背对背方式放入加热的显带液中（每缸最多可放十张玻片），培育1h后每隔5min各取出玻片1张，立即于冷水中冲洗后放于染色架上(于玻片一角标注培育时间及pH值)，直至100min全部取完。 　　3.3.3Giemsa染色 　　用新鲜配制的1:10 Giemsa液染色大约10～15分钟后，用自来水冲洗干净，干燥后置于油镜下观察染色体显带情况，记录不同条件下显带效果。 　　3.3.4统计分析 　　采用SPSS15.0的两因素多水平完全随机析因设计方差分析，分析培育温度87.5℃时pH值和显带时间的主效应，检验水准α=0.05。 　　4、结果 　　4.1显带温度与显带效果的关系 　　统计结果显示：显带液温度87.5℃，pH值6.2时，平均效应最大（50.52﹪）；显带时间75分钟时，平均效应最大（63.94﹪）。各pH值及不同显带时间之间的差异绝大部分具有统计学意义（P＜0.05）。 　　为达到最佳显带效果，显带温度87.5 C、6.5＞pH＞6.0时，随显带液pH值增高，显带时间逐渐延长，其中6.4＞pH＞6.2、显带温度65～85min时显带成功例数最多，而pH＞6.5或pH＜6.0，显带失败。 　　4.2不同疾病在相同条件下的总体显带效果 　　显带效果佳者占同组病例的比率：良性血液病为98.8﹪、AML94.7﹪、MDS94.2﹪、CML90.3﹪、ALL51.7﹪、LPD36.4﹪，即良性血液病患者的显带效果最佳，恶性血液病患者均低于良性者，其中ALL和LPD显带效果最差。 　　5、达到的性能指标 　　根据课题设计要求我们完全达到了预期的目的，研究的结果为： 　　当达到最佳显带效果，显带温度87.5℃、6.5＞pH＞6.0时，随显带液pH值增高，显带时间逐渐延长，其中6.4＞pH＞6.2、显带温度65～85min时显带成功例数最多，而pH＞6.5或pH＜6.0，显带失败。 　　从显带效果佳者占同组病例的比率上看，良性血液病患者最高（98.8﹪），恶性血液病患者均低于良性者，其中急性淋巴细胞性白血病（ALL）和淋巴细胞增殖性疾病（LPD）显带效果最差，分别为51.7﹪和36.4﹪。 　　6、结论 　　在影响骨髓细胞染色体R显带技术的诸多因素中，显带液pH值与显带时间对显带效果的影响最显著，6.4＞pH＞6.2、显带时间65～85min时显带效果最佳，且随显带液pH值增高，显带时间应逐渐延长；良性血液病患者的显带效果优于恶性者。 　　二、应用前景 　　本研究结果和结论在国内外文献未见报道，骨髓细胞染色体制备过程中R显带技术的影响因素的研究国内尚未见报道，国内相关文献大多是对外周血R显带技术的探讨。本研究的结论具有重要的应用价值和实用性，并具有可推广性，对开展此项技术的单位具有参考价值，各单位可根据不同地域的不同自然条件做适当修正。

　　一、简要技术说明 　　1、研究背景及应用领域 　　近年来，随着分子生物学与细胞遗传学的发展，骨髓染色体核型分析在血液系统疾病的诊断、治疗和预后中发挥了越来越重要的作用，在骨髓染色体显带技术中，R显带技术对揭示涉及染色体末端缺失和易位更具价值，制备出带纹清晰、易于识别的染色体是辨认微小结构异常的前提，而在影响骨髓细胞染色体R显带技术的诸多因素中，显带时间与显带液的pH对显带效果的影响较为明显，但两者对显带效果的确切影响及其关系在文献中少有论及，本研究旨通过在达到最佳显带效果时，分析两因素的相互关系，探索更佳的显带条件，培育出清晰、易于观察的R带染色体，为染色体形态异常的观察提供支持。 　　2、目的 　　探讨骨髓细胞染色体制备过程中R显带技术的影响因素，分析显带液的pH值和显带时间的相关性。 　　3、技术路线 　　3.1主要仪器及试剂 　　超净工作台、恒温培养箱、通风橱、冰箱、低温冰柜、恒温水浴箱、显微镜、立式染缸、酒精灯、水平离心机、小牛血清、RPMI1640培养瓶、谷氨酰胺、秋水仙胺、甲醇、冰醋酸、Giemsa染液、NaCl、KCl、MgSO4、CaCl2、KH2PO4、Na2HPO4、酚红、枸橼酸钠、葡萄糖等。 　　3.2实验对象 　　收集自2007年6月至2008年1月在我院就诊的门诊及住院血液病患者的骨髓液2～4ml，共278例，年龄3～78岁，良性血液病患者80例（再生障碍性贫血12例，巨幼细胞性贫血25例，溶血性贫血7例，缺铁性贫血27例，及血小板减少性紫癜9例），恶性血液病患者198例（急性粒细胞白血病75例，骨髓增生异常综合征52例，慢性粒细胞性白血病31例，急性淋巴细胞白血病29例，淋巴细胞增殖性疾病11例）。所有病例均经细胞形态学、组织细胞化学确诊，恶性血液病根据MICM分型分类。 　　3.3实验方法 　　3.3.1采集的骨髓标本经接种、骨髓短期培养后收获、制片。 　　3.3.2显带 　　分别配置pH值为5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6～6.7的显带液，分别放入50ml上述显带液于不同的立式染缸中，每缸加入葡萄糖50mg，加盖后置于预定温度87.5℃的恒温水浴箱中加温，当温度升至87.5℃，立即将上述制备好的玻片以背对背方式放入加热的显带液中（每缸最多可放十张玻片），培育1h后每隔5min各取出玻片1张，立即于冷水中冲洗后放于染色架上(于玻片一角标注培育时间及pH值)，直至100min全部取完。 　　3.3.3Giemsa染色 　　用新鲜配制的1:10 Giemsa液染色大约10～15分钟后，用自来水冲洗干净，干燥后置于油镜下观察染色体显带情况，记录不同条件下显带效果。 　　3.3.4统计分析 　　采用SPSS15.0的两因素多水平完全随机析因设计方差分析，分析培育温度87.5℃时pH值和显带时间的主效应，检验水准α=0.05。 　　4、结果 　　4.1显带温度与显带效果的关系 　　统计结果显示：显带液温度87.5℃，pH值6.2时，平均效应最大（50.52﹪）；显带时间75分钟时，平均效应最大（63.94﹪）。各pH值及不同显带时间之间的差异绝大部分具有统计学意义（P＜0.05）。 　　为达到最佳显带效果，显带温度87.5 C、6.5＞pH＞6.0时，随显带液pH值增高，显带时间逐渐延长，其中6.4＞pH＞6.2、显带温度65～85min时显带成功例数最多，而pH＞6.5或pH＜6.0，显带失败。 　　4.2不同疾病在相同条件下的总体显带效果 　　显带效果佳者占同组病例的比率：良性血液病为98.8﹪、AML94.7﹪、MDS94.2﹪、CML90.3﹪、ALL51.7﹪、LPD36.4﹪，即良性血液病患者的显带效果最佳，恶性血液病患者均低于良性者，其中ALL和LPD显带效果最差。 　　5、达到的性能指标 　　根据课题设计要求我们完全达到了预期的目的，研究的结果为： 　　当达到最佳显带效果，显带温度87.5℃、6.5＞pH＞6.0时，随显带液pH值增高，显带时间逐渐延长，其中6.4＞pH＞6.2、显带温度65～85min时显带成功例数最多，而pH＞6.5或pH＜6.0，显带失败。 　　从显带效果佳者占同组病例的比率上看，良性血液病患者最高（98.8﹪），恶性血液病患者均低于良性者，其中急性淋巴细胞性白血病（ALL）和淋巴细胞增殖性疾病（LPD）显带效果最差，分别为51.7﹪和36.4﹪。 　　6、结论 　　在影响骨髓细胞染色体R显带技术的诸多因素中，显带液pH值与显带时间对显带效果的影响最显著，6.4＞pH＞6.2、显带时间65～85min时显带效果最佳，且随显带液pH值增高，显带时间应逐渐延长；良性血液病患者的显带效果优于恶性者。 　　二、应用前景 　　本研究结果和结论在国内外文献未见报道，骨髓细胞染色体制备过程中R显带技术的影响因素的研究国内尚未见报道，国内相关文献大多是对外周血R显带技术的探讨。本研究的结论具有重要的应用价值和实用性，并具有可推广性，对开展此项技术的单位具有参考价值，各单位可根据不同地域的不同自然条件做适当修正。