本课题组从2004年开始着手进行研究，历时5年。具体研究工作如下： (一)E. coli诱导人巨噬细胞系U937细胞凋亡 1.准备细菌 大肠杆菌菌株A TCC25922 由中山大学生命科学学院提供，在LB 培养基中培养16 h 后离心沉淀细菌，然后用PBS 洗2 次。按旋转涂布方法测菌落形成单位(CFU)。计数E. coli，约为8 ×108 /ml。用不含抗生素的含5 %小牛血清的RPMI 1640培养基重悬并稀释，使其浓度分别为1×107 / ml，2×107 / ml，4×107 / ml，1×108 / ml 和2×108 / ml。 2.细胞培养和E. coli 感染U937 U937 细胞在含10 %小牛血清的RPMI 1640 培养基中培养，该培养基中还含有2mM/L谷氨酸钠，100U/ ml 青霉素，和100 g / ml链霉素，在含有5 % CO2的37℃培养箱中培养。在细菌感染前，用不含抗生素的RPMI 1640 培养基将U937细胞清洗并重悬，将其浓度调整至2 ×106 / ml，然后当细胞:细菌分别为1:5，1:10，1:20，1:50 和1:100 时37 ℃的细胞培养箱中分别培养30min，然后当细胞:细菌为1:20时，37 ℃的细胞培养箱中分别培养0 min，10min，20 min，30 min，60 min和90min，离心2 次(220 g，8 min) 洗去未吞噬细菌，置于含小牛血清、2 倍青霉素及链霉素的RPMI 1640 培养基中培养3 h，获得感染的U937 细胞。 3.细胞活性测定 为了检测E. coli 感染后U937 细胞的活率，依据上述过程感染细胞。当细胞与细菌浓度比不同及感染时间不同时，用PBS 将U937 细胞洗2 次，然后用0.4 %的台盼蓝溶液处理，在显微镜下观察细胞。那些细胞膜已经破坏的U937 细胞已经死亡，可以被台盼蓝染成蓝色。该实验至少重复3次。计数不同的细胞与细菌浓度比以及不同感染时间时，胞膜完整的活细胞在所有细胞中所占的百分率。 4.Hoechst 33258 染色 凋亡的细胞核改变的特点包括：核碎裂，核膜降解以及细胞核出泡等，导致凋亡小体的形成。通过该染色能够在显微镜下看到凋亡的形态学特点如染色质凝聚和核碎裂。收集U937 细胞并且用PBS洗两次，然后用Hoechst 33258 染色(Molecular Probes Inc.，Eugene，USA) 将其稀释为1 : 600避光染色5 min。在荧光显微镜下观察结果。 5.Annexin V FITC/ PI 双染流式细胞仪分析 U937 细胞的凋亡率用流式细胞仪检测。106 细胞加入含有annexin V 的60μl 结合缓冲液4 ℃避光15 min。为了区别早期凋亡和晚期凋亡或坏死细胞，细胞在检测前同时染annexin V 和PI。细胞结合annexin V/FITC 和PI 后其结果采用CellQuest 软件用流式细胞仪进行分析。每个样品至少计数10，000 个细胞。 (二)MAPK家族中的p38MAPK、ERK1/2和JNK，Bcl-2和Bax在E. coli诱导U937细胞凋亡的过程中的作用Western blot 印迹检测细菌感染细胞后用冰冷的PBS 洗1 次。包括1mmol/ L Na2VO4 和溶解缓冲液(50 mmol/ L Tris，p H 810，150 mmol/ L NaCl，5 mmol/ L EDTA，5 % Glycerol，1 % Triton X2100，25 mmol/ L NaF，2 mmol/ L Na2 VO4，10μg/ ml 的各种抑肽酶，亮肽素和抑肽素)。细胞溶解产物被冰冻和融化3次，然后在4 ℃14，000 ×g 离心10 min。提取的细胞上清用DC 蛋白分析试剂盒，用Lowry 法测定总蛋白浓度(Bio2Rad，Hercules，CA)。按每孔加总蛋白50μg，进行SDS2PA GE 凝胶电泳后电转移至硝酸纤维素滤膜上( PVDF 膜) (MSI，Westbor2 ough，MA)。膜在包括Tween220 ( TBST)的三羟甲基氨基甲烷缓冲液中用5 %的脱脂奶粉封闭，然后加入抗体4℃孵育过夜。应用Actin (1:2000) 使蛋白量保持一致。然后用TBS2T 缓冲液洗3 次，加入辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgM ( Santa Cruz，CA)，然后用化学发光法显色( PIERCE，Rockford , IL)。将滤膜用凝胶成像分析系统进行扫描读取各条带的吸光度A 值。 (三) caspase-3、9在E. coli诱导U937细胞凋亡中的作用 细胞内caspase-3/-9 蛋白酶活性测定： 收集并裂解细胞，冰上孵育10 min，4 ℃ 离心( 10 000 r/min) 5 min，取上清，分别加入反应缓冲液/DTT 混合物及caspase-3/-9 底物，37 ℃水浴1 h。选择405 nm波长，ELISA 法分析caspase-3/-9 蛋白酶活性。 (四)统计学分析 每个实验至少重复3～4 次。结果用均数±标准差(SD) 表示，用SPSS 1115 软件进行分析。采用方差分析(ANOVA)。组间比较采用t 检验。当P ＜ 0.05 时认为具有统计学意义。 我们的结果证明了E. coli能够以时间和剂量依赖的方式诱导人巨噬细胞系U937细胞凋亡并且其机制涉及Bcl-2表达下调和Bax表达上调；HSP70的表达随着E. coli浓度的增加逐渐升高，而NF-κB的表达逐渐降低。MAPK信号转导通路中的p38MAPK和JNK的磷酸化水平随着时间的延长而增加，而ERK1/2的磷酸化水平则呈时间依赖性降低；Caspase-3和-9的活性随着时间的延长而增加；加入p38MAPK和JNK的抑制剂可抑制Caspase-3和-9的活性及U937 细胞的凋亡率；而加入ERK1/2的抑制剂可使Caspase-3和-9的活性及U937 细胞的凋亡率增加；加入Caspase-3和-9的抑制剂可抑制Caspase-3和-9的活性及U937 细胞的凋亡率；说明MAPK信号转导通路和Caspase-3和-9在E.coli 诱导的U937细胞凋亡过程中起到了重要的作用。 本课题先后获省部级基金资助2项，加上学校和医院学科投入，总研究经费约十余万元，共有34篇论文在国内外核心杂志发表，被SCI收录3 篇，被Medline收录4篇。

本课题组从2004年开始着手进行研究，历时5年。具体研究工作如下： (一)E. coli诱导人巨噬细胞系U937细胞凋亡 1.准备细菌 大肠杆菌菌株A TCC25922 由中山大学生命科学学院提供，在LB 培养基中培养16 h 后离心沉淀细菌，然后用PBS 洗2 次。按旋转涂布方法测菌落形成单位(CFU)。计数E. coli，约为8 ×108 /ml。用不含抗生素的含5 %小牛血清的RPMI 1640培养基重悬并稀释，使其浓度分别为1×107 / ml，2×107 / ml，4×107 / ml，1×108 / ml 和2×108 / ml。 2.细胞培养和E. coli 感染U937 U937 细胞在含10 %小牛血清的RPMI 1640 培养基中培养，该培养基中还含有2mM/L谷氨酸钠，100U/ ml 青霉素，和100 g / ml链霉素，在含有5 % CO2的37℃培养箱中培养。在细菌感染前，用不含抗生素的RPMI 1640 培养基将U937细胞清洗并重悬，将其浓度调整至2 ×106 / ml，然后当细胞:细菌分别为1:5，1:10，1:20，1:50 和1:100 时37 ℃的细胞培养箱中分别培养30min，然后当细胞:细菌为1:20时，37 ℃的细胞培养箱中分别培养0 min，10min，20 min，30 min，60 min和90min，离心2 次(220 g，8 min) 洗去未吞噬细菌，置于含小牛血清、2 倍青霉素及链霉素的RPMI 1640 培养基中培养3 h，获得感染的U937 细胞。 3.细胞活性测定 为了检测E. coli 感染后U937 细胞的活率，依据上述过程感染细胞。当细胞与细菌浓度比不同及感染时间不同时，用PBS 将U937 细胞洗2 次，然后用0.4 %的台盼蓝溶液处理，在显微镜下观察细胞。那些细胞膜已经破坏的U937 细胞已经死亡，可以被台盼蓝染成蓝色。该实验至少重复3次。计数不同的细胞与细菌浓度比以及不同感染时间时，胞膜完整的活细胞在所有细胞中所占的百分率。 4.Hoechst 33258 染色 凋亡的细胞核改变的特点包括：核碎裂，核膜降解以及细胞核出泡等，导致凋亡小体的形成。通过该染色能够在显微镜下看到凋亡的形态学特点如染色质凝聚和核碎裂。收集U937 细胞并且用PBS洗两次，然后用Hoechst 33258 染色(Molecular Probes Inc.，Eugene，USA) 将其稀释为1 : 600避光染色5 min。在荧光显微镜下观察结果。 5.Annexin V FITC/ PI 双染流式细胞仪分析 U937 细胞的凋亡率用流式细胞仪检测。106 细胞加入含有annexin V 的60μl 结合缓冲液4 ℃避光15 min。为了区别早期凋亡和晚期凋亡或坏死细胞，细胞在检测前同时染annexin V 和PI。细胞结合annexin V/FITC 和PI 后其结果采用CellQuest 软件用流式细胞仪进行分析。每个样品至少计数10，000 个细胞。 (二)MAPK家族中的p38MAPK、ERK1/2和JNK，Bcl-2和Bax在E. coli诱导U937细胞凋亡的过程中的作用Western blot 印迹检测细菌感染细胞后用冰冷的PBS 洗1 次。包括1mmol/ L Na2VO4 和溶解缓冲液(50 mmol/ L Tris，p H 810，150 mmol/ L NaCl，5 mmol/ L EDTA，5 % Glycerol，1 % Triton X2100，25 mmol/ L NaF，2 mmol/ L Na2 VO4，10μg/ ml 的各种抑肽酶，亮肽素和抑肽素)。细胞溶解产物被冰冻和融化3次，然后在4 ℃14，000 ×g 离心10 min。提取的细胞上清用DC 蛋白分析试剂盒，用Lowry 法测定总蛋白浓度(Bio2Rad，Hercules，CA)。按每孔加总蛋白50μg，进行SDS2PA GE 凝胶电泳后电转移至硝酸纤维素滤膜上( PVDF 膜) (MSI，Westbor2 ough，MA)。膜在包括Tween220 ( TBST)的三羟甲基氨基甲烷缓冲液中用5 %的脱脂奶粉封闭，然后加入抗体4℃孵育过夜。应用Actin (1:2000) 使蛋白量保持一致。然后用TBS2T 缓冲液洗3 次，加入辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgM ( Santa Cruz，CA)，然后用化学发光法显色( PIERCE，Rockford , IL)。将滤膜用凝胶成像分析系统进行扫描读取各条带的吸光度A 值。 (三) caspase-3、9在E. coli诱导U937细胞凋亡中的作用 细胞内caspase-3/-9 蛋白酶活性测定： 收集并裂解细胞，冰上孵育10 min，4 ℃ 离心( 10 000 r/min) 5 min，取上清，分别加入反应缓冲液/DTT 混合物及caspase-3/-9 底物，37 ℃水浴1 h。选择405 nm波长，ELISA 法分析caspase-3/-9 蛋白酶活性。 (四)统计学分析 每个实验至少重复3～4 次。结果用均数±标准差(SD) 表示，用SPSS 1115 软件进行分析。采用方差分析(ANOVA)。组间比较采用t 检验。当P ＜ 0.05 时认为具有统计学意义。 我们的结果证明了E. coli能够以时间和剂量依赖的方式诱导人巨噬细胞系U937细胞凋亡并且其机制涉及Bcl-2表达下调和Bax表达上调；HSP70的表达随着E. coli浓度的增加逐渐升高，而NF-κB的表达逐渐降低。MAPK信号转导通路中的p38MAPK和JNK的磷酸化水平随着时间的延长而增加，而ERK1/2的磷酸化水平则呈时间依赖性降低；Caspase-3和-9的活性随着时间的延长而增加；加入p38MAPK和JNK的抑制剂可抑制Caspase-3和-9的活性及U937 细胞的凋亡率；而加入ERK1/2的抑制剂可使Caspase-3和-9的活性及U937 细胞的凋亡率增加；加入Caspase-3和-9的抑制剂可抑制Caspase-3和-9的活性及U937 细胞的凋亡率；说明MAPK信号转导通路和Caspase-3和-9在E.coli 诱导的U937细胞凋亡过程中起到了重要的作用。 本课题先后获省部级基金资助2项，加上学校和医院学科投入，总研究经费约十余万元，共有34篇论文在国内外核心杂志发表，被SCI收录3 篇，被Medline收录4篇。