本研究利用基因克隆技术成功构建了含HPV16 E6基因原核表达质粒的工程菌pET-28a（+）-HPV16E6-BL21 Star- DE3 PlysS，经IPTG诱导表达HPV16E6蛋白，镍柱亲和层析纯化HPV16E6蛋白作为抗原多次免疫家兔，用间接ELISA方法检测兔抗HPV16E6蛋白多克隆抗体的效价高达1：256000。用获得的HPV16E6蛋白作为抗原免疫雌性Balb/C小鼠，用间接ELISA方法检测鼠抗HPV16E6蛋白多克隆抗体血清的效价高达1：64000。将免疫5次高效价的Balb/C小鼠的脾细胞与同系小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，融合率达96％，经间接ELISA检测、有限稀释法克隆，筛选出了6株能稳定分泌特异性抗鸡传染性支气管炎抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1F9、2F10、3C5、3C6、4D4、5B10。将这6株细胞扩大培养注射Balb/C小鼠，每株细胞各注射2只鼠以制备腹水单抗，用饱和硫酸铵纯化这些单抗，6株单抗的类型属于IgG类。细胞免疫化学检测时这些单抗仅与Caski细胞（含HPV16型）发生特异性反应，而不与其Hela细胞发生反应，免疫组织化学检测时这些单抗只与宫颈癌鳞癌组织（含HPV16）发生反应，而不与宫颈癌腺癌（含HPV18）发生反应。 用获得的单抗和多抗建立了检测HPV16的ELISA法—双抗夹心ELISA法检测HPV16。用4D4这株杂交瘤细胞产生的单抗作料8个稀释度，从2ug/ml倍比稀释至15ng/ml进行包被，将待检测的HPV16E6蛋白稀释10个浓度。从500ng/ml倍比稀释至0.09375ng/ml，设置HPV16L1蛋白为阴性对照，PBST为空白对照，加入的兔抗HPV16E6蛋白多抗的浓度为1.8ug/ml，即每孔的多抗为0.18ug，最后的结果为当单抗的包被浓度从2ug/ml倍比稀释至15ng/ml时，检测出HPV16E6蛋白的最低量可达7.5ng，如果提高加入多抗的浓度，检测出HPV16E6蛋白的最低量可达3.75ng或更低。 用鼠单抗IgG作为抗原免疫兔子多次，用间接ELISA方法检测获得了高效价的兔抗鼠单抗IgG的多克隆抗体血清，其效价高达1：256000。饱和硫酸铵纯化兔抗鼠单抗IgG的抗抗体即二抗。 用获得的单克隆抗体、多克隆抗体和二抗建立了高危型人乳头瘤病毒HPV16的胶体金免疫层析快速诊断方法。根据实验需求制备了30 nm的胶体金颗粒，对单克隆抗体（4D4株）最适稳定标记量进行测定，选择100 ml 0.01％金溶胶中的HPV16E6单抗标记量为6 ug/ml。通过最适稳定标记量对单克隆抗体进行标记，成功制备了性能稳定、免疫学活性好的金标HPV16E6单克隆抗体，该金标抗体在4℃保存半年未见有沉淀或分层现象。 将制备好的金标抗体、纯化的兔抗HPV16E6多抗和兔抗鼠IgG的抗抗体即二抗用于免疫胶体金诊断试剂条的制备。反应体系将金标抗体固定于玻璃纤维膜上作为显色源，将兔抗HPV16E6多抗喷画在硝酸纤维素膜上作为捕获线，兔抗鼠IgG的抗抗体即二抗固定在硝酸纤维素膜上作为质检线，通过确定各部分最佳喷涂量后制成免疫胶体金诊断试纸条。在检测过程中若待检样品中含有HPV16E6抗原，则在有效的检测试剂条上捕获线和质检线处均出现一条红线，若待检样品中不含HPV16E6抗原则只在质检线处出现一条红线。通过结果的判定，该快速检测测试条灵敏度可达7.5 ng/ml。同时本试验将自制的单克隆抗体用于免疫细胞化学检测，这些单抗仅与Caski细胞（含HPV16型）发生特异性反应，而不与其Hela细胞发生反应；用于组织免疫化学检测时，这些单抗只与宫颈癌鳞癌组织（含HPV16）发生反应，而不与宫颈癌腺癌（含HPV18）发生反应。显示了这些单抗有较强的特异性。本项目研制的高危型人乳头瘤病毒免疫胶体金试纸条检测HPV16E6蛋白为阳性，检测重组的HPV16L1蛋白为阴性，显示了较好的特异性。 本研究成功制备了抗HPV16E6蛋白的多克隆抗体及单克隆抗体，并将其应用在HPV16E6的诊断上，初步制成了高危型人乳头瘤病毒免疫胶体金试纸条。

本研究利用基因克隆技术成功构建了含HPV16 E6基因原核表达质粒的工程菌pET-28a（+）-HPV16E6-BL21 Star- DE3 PlysS，经IPTG诱导表达HPV16E6蛋白，镍柱亲和层析纯化HPV16E6蛋白作为抗原多次免疫家兔，用间接ELISA方法检测兔抗HPV16E6蛋白多克隆抗体的效价高达1：256000。用获得的HPV16E6蛋白作为抗原免疫雌性Balb/C小鼠，用间接ELISA方法检测鼠抗HPV16E6蛋白多克隆抗体血清的效价高达1：64000。将免疫5次高效价的Balb/C小鼠的脾细胞与同系小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，融合率达96％，经间接ELISA检测、有限稀释法克隆，筛选出了6株能稳定分泌特异性抗鸡传染性支气管炎抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1F9、2F10、3C5、3C6、4D4、5B10。将这6株细胞扩大培养注射Balb/C小鼠，每株细胞各注射2只鼠以制备腹水单抗，用饱和硫酸铵纯化这些单抗，6株单抗的类型属于IgG类。细胞免疫化学检测时这些单抗仅与Caski细胞（含HPV16型）发生特异性反应，而不与其Hela细胞发生反应，免疫组织化学检测时这些单抗只与宫颈癌鳞癌组织（含HPV16）发生反应，而不与宫颈癌腺癌（含HPV18）发生反应。 用获得的单抗和多抗建立了检测HPV16的ELISA法—双抗夹心ELISA法检测HPV16。用4D4这株杂交瘤细胞产生的单抗作料8个稀释度，从2ug/ml倍比稀释至15ng/ml进行包被，将待检测的HPV16E6蛋白稀释10个浓度。从500ng/ml倍比稀释至0.09375ng/ml，设置HPV16L1蛋白为阴性对照，PBST为空白对照，加入的兔抗HPV16E6蛋白多抗的浓度为1.8ug/ml，即每孔的多抗为0.18ug，最后的结果为当单抗的包被浓度从2ug/ml倍比稀释至15ng/ml时，检测出HPV16E6蛋白的最低量可达7.5ng，如果提高加入多抗的浓度，检测出HPV16E6蛋白的最低量可达3.75ng或更低。 用鼠单抗IgG作为抗原免疫兔子多次，用间接ELISA方法检测获得了高效价的兔抗鼠单抗IgG的多克隆抗体血清，其效价高达1：256000。饱和硫酸铵纯化兔抗鼠单抗IgG的抗抗体即二抗。 用获得的单克隆抗体、多克隆抗体和二抗建立了高危型人乳头瘤病毒HPV16的胶体金免疫层析快速诊断方法。根据实验需求制备了30 nm的胶体金颗粒，对单克隆抗体（4D4株）最适稳定标记量进行测定，选择100 ml 0.01％金溶胶中的HPV16E6单抗标记量为6 ug/ml。通过最适稳定标记量对单克隆抗体进行标记，成功制备了性能稳定、免疫学活性好的金标HPV16E6单克隆抗体，该金标抗体在4℃保存半年未见有沉淀或分层现象。 将制备好的金标抗体、纯化的兔抗HPV16E6多抗和兔抗鼠IgG的抗抗体即二抗用于免疫胶体金诊断试剂条的制备。反应体系将金标抗体固定于玻璃纤维膜上作为显色源，将兔抗HPV16E6多抗喷画在硝酸纤维素膜上作为捕获线，兔抗鼠IgG的抗抗体即二抗固定在硝酸纤维素膜上作为质检线，通过确定各部分最佳喷涂量后制成免疫胶体金诊断试纸条。在检测过程中若待检样品中含有HPV16E6抗原，则在有效的检测试剂条上捕获线和质检线处均出现一条红线，若待检样品中不含HPV16E6抗原则只在质检线处出现一条红线。通过结果的判定，该快速检测测试条灵敏度可达7.5 ng/ml。同时本试验将自制的单克隆抗体用于免疫细胞化学检测，这些单抗仅与Caski细胞（含HPV16型）发生特异性反应，而不与其Hela细胞发生反应；用于组织免疫化学检测时，这些单抗只与宫颈癌鳞癌组织（含HPV16）发生反应，而不与宫颈癌腺癌（含HPV18）发生反应。显示了这些单抗有较强的特异性。本项目研制的高危型人乳头瘤病毒免疫胶体金试纸条检测HPV16E6蛋白为阳性，检测重组的HPV16L1蛋白为阴性，显示了较好的特异性。 本研究成功制备了抗HPV16E6蛋白的多克隆抗体及单克隆抗体，并将其应用在HPV16E6的诊断上，初步制成了高危型人乳头瘤病毒免疫胶体金试纸条。