一、项目来源： 　　厦门市卫生局2006年重点资助医学科研项目（WSK2006-05），计划研制霍乱弧菌多重荧光PCR快速定群检测试剂盒，应用脉冲场电泳分析法（PFGE）研究厦门外环境霍乱菌株的分子流行病学特征，揭示霍乱的发生和流行的变化规律。发表学术论文2篇以上。 　　二、项目研究背景与同类技术概况： 　　霍乱(Cholera)是按照甲类传染病和国境检疫传染病之一。霍乱弧菌多于200个血清群，O1和O139群是霍乱病原菌，又分为产毒株和非产毒株。细菌学方法是各类标本的标准检验方法，辅助方法包括胶体金、PCR等快速检验。胶体金的检测灵敏度不足，只作为辅助手段。目前PCR试剂盒多为单重或定性方法，分别检测血清群别或肠毒素基因(ctx)，须进行多次实验。霍乱防控工作中检测检验标本种类与数量繁多，而这些方法操作繁琐、效率较低。 　　三、项目研究内容、技术性能： 　　1.定群检测试剂盒研制： 　　根据霍乱弧菌的种、群特异性基因和ctx基因序列分别设计HAND引物和颈环分子信标探针，应用了“Touch-down PCR”技术，成功研制霍乱弧菌的多色荧光四重PCR检测技术，在一次试验中3小时内可快速确定标本中是否有O1或O139群霍乱弧菌及含菌量、是否属于产肠毒素株，检测限2-20CFU，特异性100﹪；适用于各种标本类型的定群检测和菌株鉴定。 　　2.溯源分析： 　　总结13年来本地外环境水体和水产品5万份标本霍乱病原监测的概况，建立了PulseNet China网络的本地数据并扩充网络数据库，这是霍乱防控的重要决策依据。牛蛙和养殖池累计检出率分别为6.48﹪和1.69﹪，显著高于同期监测的其它水体和水产品；分离的菌株属于非产肠毒素株，不具备转变为产肠毒素株的主要遗传基础，PFGE分析发现菌株趋异性高、群别分布离散，与产肠毒素菌株差异显著，牛蛙养殖池中霍乱弧菌可长期存活，与周围水体交互污染，但分子流行病学分析和现场流行病学调查都未发现与霍乱疫情有关联。据此提出了牛蛙等水产殖污染霍乱弧菌处置指导性方法：应首先判断是否属于产肠毒素株，属于非产肠毒素株时则不必视同霍乱疫源，但仍然需要加强监测。 　　四、成果的创造性与先进性： 　　1.霍乱弧菌多重荧光PCR快速定群检测试剂盒：在一次试验中可快速确定标本中是否有O1或O139群霍乱弧菌及含菌量、是否属于产肠毒素株。 　　2.HAND引物多重PCR技术：HAND（Homo-Tag Assisted Non-Dimer）引物技术，结合Touch-down PCR技术，将多重PCR转化为多基因片段扩增的类单重PCR，有效抑制引物二聚体的形成，解决了困扰多重PCR效率的主要难题。 　　3.颈环分子信标探针技术：与普通分子信标探针比较，颈环分子信标探针颈部碱基和靶序列互补，在退火阶段保持稳定，本底信号低，减少多重PCR中共存探针间的干扰，显著提高探针杂交识别能力。 　　4.霍乱弧菌PulseNet溯源分析：全面地分析了牛蛙养殖相关霍乱弧菌非产肠毒素株分子流行病学特征，建立了PμlseNet China网络的本地数据并扩充网络数据库。据此提出了牛蛙等水产殖污染霍乱弧菌处置指导性方法。 　　五、项目的研究意义和应用范围： 　　霍乱弧菌多重荧光PCR快速定群检测技术已成为我市霍乱监测和应急处置、食品安全等工作的重要技术支撑之一；已在本市日常疾控工作和多次较大社会影响的应急事件中得到实际应用和验证，对重大卫生保障和食源性致病菌快速检测发挥重要作用，进一步推广应用有利于提高对突发事件的应急反应能力。目前已初步转化商品试剂盒，可产生一定经济效益。 　　溯源分析提出的关于牛蛙养殖中霍乱弧菌的处置方法，科学有效地解决牛蛙等水产养殖污染霍乱弧菌的问题，既节省大量的人力物力，也可避免疫情处置而导致的大量经济损失和负面社会影响，取得了较好的社会效益。

　　一、项目来源： 　　厦门市卫生局2006年重点资助医学科研项目（WSK2006-05），计划研制霍乱弧菌多重荧光PCR快速定群检测试剂盒，应用脉冲场电泳分析法（PFGE）研究厦门外环境霍乱菌株的分子流行病学特征，揭示霍乱的发生和流行的变化规律。发表学术论文2篇以上。 　　二、项目研究背景与同类技术概况： 　　霍乱(Cholera)是按照甲类传染病和国境检疫传染病之一。霍乱弧菌多于200个血清群，O1和O139群是霍乱病原菌，又分为产毒株和非产毒株。细菌学方法是各类标本的标准检验方法，辅助方法包括胶体金、PCR等快速检验。胶体金的检测灵敏度不足，只作为辅助手段。目前PCR试剂盒多为单重或定性方法，分别检测血清群别或肠毒素基因(ctx)，须进行多次实验。霍乱防控工作中检测检验标本种类与数量繁多，而这些方法操作繁琐、效率较低。 　　三、项目研究内容、技术性能： 　　1.定群检测试剂盒研制： 　　根据霍乱弧菌的种、群特异性基因和ctx基因序列分别设计HAND引物和颈环分子信标探针，应用了“Touch-down PCR”技术，成功研制霍乱弧菌的多色荧光四重PCR检测技术，在一次试验中3小时内可快速确定标本中是否有O1或O139群霍乱弧菌及含菌量、是否属于产肠毒素株，检测限2-20CFU，特异性100﹪；适用于各种标本类型的定群检测和菌株鉴定。 　　2.溯源分析： 　　总结13年来本地外环境水体和水产品5万份标本霍乱病原监测的概况，建立了PulseNet China网络的本地数据并扩充网络数据库，这是霍乱防控的重要决策依据。牛蛙和养殖池累计检出率分别为6.48﹪和1.69﹪，显著高于同期监测的其它水体和水产品；分离的菌株属于非产肠毒素株，不具备转变为产肠毒素株的主要遗传基础，PFGE分析发现菌株趋异性高、群别分布离散，与产肠毒素菌株差异显著，牛蛙养殖池中霍乱弧菌可长期存活，与周围水体交互污染，但分子流行病学分析和现场流行病学调查都未发现与霍乱疫情有关联。据此提出了牛蛙等水产殖污染霍乱弧菌处置指导性方法：应首先判断是否属于产肠毒素株，属于非产肠毒素株时则不必视同霍乱疫源，但仍然需要加强监测。 　　四、成果的创造性与先进性： 　　1.霍乱弧菌多重荧光PCR快速定群检测试剂盒：在一次试验中可快速确定标本中是否有O1或O139群霍乱弧菌及含菌量、是否属于产肠毒素株。 　　2.HAND引物多重PCR技术：HAND（Homo-Tag Assisted Non-Dimer）引物技术，结合Touch-down PCR技术，将多重PCR转化为多基因片段扩增的类单重PCR，有效抑制引物二聚体的形成，解决了困扰多重PCR效率的主要难题。 　　3.颈环分子信标探针技术：与普通分子信标探针比较，颈环分子信标探针颈部碱基和靶序列互补，在退火阶段保持稳定，本底信号低，减少多重PCR中共存探针间的干扰，显著提高探针杂交识别能力。 　　4.霍乱弧菌PulseNet溯源分析：全面地分析了牛蛙养殖相关霍乱弧菌非产肠毒素株分子流行病学特征，建立了PμlseNet China网络的本地数据并扩充网络数据库。据此提出了牛蛙等水产殖污染霍乱弧菌处置指导性方法。 　　五、项目的研究意义和应用范围： 　　霍乱弧菌多重荧光PCR快速定群检测技术已成为我市霍乱监测和应急处置、食品安全等工作的重要技术支撑之一；已在本市日常疾控工作和多次较大社会影响的应急事件中得到实际应用和验证，对重大卫生保障和食源性致病菌快速检测发挥重要作用，进一步推广应用有利于提高对突发事件的应急反应能力。目前已初步转化商品试剂盒，可产生一定经济效益。 　　溯源分析提出的关于牛蛙养殖中霍乱弧菌的处置方法，科学有效地解决牛蛙等水产养殖污染霍乱弧菌的问题，既节省大量的人力物力，也可避免疫情处置而导致的大量经济损失和负面社会影响，取得了较好的社会效益。