本研究将柞蚕溶菌酶基因cDNA克隆到酵母表达载体pPIC9K中，载体中原有的信号肽序列被柞蚕溶菌酶自身的信号肽序列所取代。重组质粒DNA用BglⅡ酶切后，电转化方法将其导入毕赤酵母菌GS115(His4)中。在含有4mg/mlG418的YPD培养基上选出高拷贝的转化菌株。利用MM和MD培养基进一步确定所选出的高拷贝菌建立了柞蚕溶菌酶的毕赤酵母表达系统。使用柞蚕溶菌酶自身的信号肽序列，柞蚕溶菌酶在毕赤酵母细胞中得到正确表达并有效地将成熟柞蚕溶菌酶分泌到酵母细胞外。柞蚕溶菌酶在酵母菌中的表达是在0.5%甲醇诱导下，30℃培养96小时达到高峰。利用离子交换方法纯化表达产物，纯化的重组柞蚕溶菌酶分子量约为20,000道尔顿，其N端氨基酸序列为KWFTK，与预测的成熟柞蚕溶菌酶序列一致。Endo H酶解结果证实，重组柞蚕溶菌酶是经过糖基化修饰的，低聚糖以N-链形式附在柞蚕溶菌酶上。重组的柞蚕溶菌酶对变形链球菌有抑制其生长的作用。 　　溶菌酶具有多种药理作用，它的应用越来越受到重视。当前，我国溶菌酶的研究和应用尚处于起步阶段，国内厂家基本上采用蛋厂鸡蛋壳中残留的蛋清为原料生产溶菌酶，产量较低，不具有糖基化性质。国内最大蛋清溶菌酶生产企业，年产盐酸蛋清溶菌酶20吨。目前世界每年溶菌酶总产量共为300吨，而需求量却为1000吨，现行的产量远不能满足市场的需要。而国外一些研究单位，也已开始研制具有糖基化性质的溶菌酶。本项研究通过采用酵母载体表达系统体外表达并纯化柞蚕溶菌酶，不依赖鸡蛋清作原料，开发新的溶菌酶资源。利用该方法制备的溶菌酶具有糖基化性质，这也填补了国内无糖基化溶菌酶研制的空白，并且克服了重组蛋白的不均一性，这对如何利用酵母细胞获得氨基酸结构均一的重组蛋白有重要的参考价值。重组柞蚕溶菌酶对变形链球菌生长的抑制作用，对龋病的防治具有理论意义和应用价值。同时对柞蚕溶菌酶进一步产业开发，还可满足上述市场需求，具有广泛的应用前景，并将直接产生经济效益和社会效益。

　　本研究将柞蚕溶菌酶基因cDNA克隆到酵母表达载体pPIC9K中，载体中原有的信号肽序列被柞蚕溶菌酶自身的信号肽序列所取代。重组质粒DNA用BglⅡ酶切后，电转化方法将其导入毕赤酵母菌GS115(His4)中。在含有4mg/mlG418的YPD培养基上选出高拷贝的转化菌株。利用MM和MD培养基进一步确定所选出的高拷贝菌建立了柞蚕溶菌酶的毕赤酵母表达系统。使用柞蚕溶菌酶自身的信号肽序列，柞蚕溶菌酶在毕赤酵母细胞中得到正确表达并有效地将成熟柞蚕溶菌酶分泌到酵母细胞外。柞蚕溶菌酶在酵母菌中的表达是在0.5%甲醇诱导下，30℃培养96小时达到高峰。利用离子交换方法纯化表达产物，纯化的重组柞蚕溶菌酶分子量约为20,000道尔顿，其N端氨基酸序列为KWFTK，与预测的成熟柞蚕溶菌酶序列一致。Endo H酶解结果证实，重组柞蚕溶菌酶是经过糖基化修饰的，低聚糖以N-链形式附在柞蚕溶菌酶上。重组的柞蚕溶菌酶对变形链球菌有抑制其生长的作用。 　　溶菌酶具有多种药理作用，它的应用越来越受到重视。当前，我国溶菌酶的研究和应用尚处于起步阶段，国内厂家基本上采用蛋厂鸡蛋壳中残留的蛋清为原料生产溶菌酶，产量较低，不具有糖基化性质。国内最大蛋清溶菌酶生产企业，年产盐酸蛋清溶菌酶20吨。目前世界每年溶菌酶总产量共为300吨，而需求量却为1000吨，现行的产量远不能满足市场的需要。而国外一些研究单位，也已开始研制具有糖基化性质的溶菌酶。本项研究通过采用酵母载体表达系统体外表达并纯化柞蚕溶菌酶，不依赖鸡蛋清作原料，开发新的溶菌酶资源。利用该方法制备的溶菌酶具有糖基化性质，这也填补了国内无糖基化溶菌酶研制的空白，并且克服了重组蛋白的不均一性，这对如何利用酵母细胞获得氨基酸结构均一的重组蛋白有重要的参考价值。重组柞蚕溶菌酶对变形链球菌生长的抑制作用，对龋病的防治具有理论意义和应用价值。同时对柞蚕溶菌酶进一步产业开发，还可满足上述市场需求，具有广泛的应用前景，并将直接产生经济效益和社会效益。