一、任务来源： 　　省卫生厅医学科研基金结转项目计划课题，吉卫指标函[2003]13号。 　　二、应用领域和技术原理： 　　用于治疗糖尿病探讨，如果利用体外诱导骨髓间充质干细胞产生胰岛素的β细胞治疗糖尿病得到肯定，将会造福于人类。 　　技术原理： 　　（一）骨髓间充质干细胞的分离培养、鉴定及生物学特征鉴定； 　　（二）鉴定骨髓间充质干细胞定向诱导分化特性； 　　（三）骨髓MSCs向胰岛样细胞分化、鉴定诱导分化细胞； 　　（四）制作糖尿病模型； 　　（五）移植诱导分化的胰岛细胞至糖尿病模型，观察治疗效果。 　　三、性能指标： 　　主要采用细胞和分子生物学及其他方法通过体内体外进行实验。培养诱导细胞转化，鉴定所诱导分化的细胞，并检测分化细胞的功能。 　　（一）动物及骨髓间充质干细胞的分离培养、鉴定及生物学特征鉴定： 　　1、流式细胞仪鉴定分离培养的细胞表面标记； 　　2、细胞纯化程度鉴定，证明所培养的细胞为均一的细胞。 　　（二）鉴定骨髓间充质干细胞定向诱导分化特性： 　　1、外骨髓MSCs分化成软骨细胞； 　　2、骨髓MSCs分化成脂肪细胞。 　　（三）正常胰岛细胞的培养与鉴定。 　　（四）骨髓间充质干细胞体外诱导分化胰岛细胞： 　　1、添加诱导因子进行诱导分化培养，分化细胞的筛选； 　　2、促进分化细胞成熟； 　　3、分化细胞的鉴定：通过细胞表面标志和组织化学方法进行鉴定。 　　（1）形态学观察； 　　（2）电镜观察； 　　（3）组织化学鉴定（双硫腙染色）； 　　（4）免疫细胞化学检测：鉴定胰岛素、胰岛素样生长因子抗原表达； 　　（5）Western blot检测胰岛素表达。 　　（五）骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛样细胞对坏死胰腺组织的修复： 　　1、骨髓单核细胞的制备； 　　2、胰腺坏死模型的制作； 　　3、实验组局部移植DAPI标记的已诱导的骨髓间充质干细胞，对照组移植骨髓单核细胞（5×106个细胞/100μL）。 　　（六）骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛样细胞对糖尿病大鼠的治疗作用： 　　1、大鼠糖尿病模型的制作： 　　使用链脲菌素（Streptozotocin，STZ）制作糖尿病模型（Wistar rat model of diabetes mellitus）； 　　2、大鼠糖尿病模型鉴定； 　　3、治疗效果移植诱导分化的胰岛细胞至糖尿病模型，观察治疗效果。 　　四、成果的创造性和先进性： 　　1、首次证明了诱导骨髓间充质干细胞转化为胰岛样细胞的培养体系（特异刺激因子）、程序及方法； 　　2、首次证实了诱导的胰岛样细胞可替代坏死胰腺组织，促进受体胰腺组织的修复，明显提高胰腺坏死大鼠的存活率； 　　3、首次证实了骨髓MSC诱导转化的胰岛样细胞移植可以降低糖尿病大鼠血糖、尿糖水平，改善糖尿病症状。并提出细胞移植可以替代、补充受体功能异常细胞的功能，还有可能使受体受损细胞功能恢复正常。 　　五、推广应用的范围、条件和前景以及存在的问题和改进意见： 　　该研究结果可应用于治疗糖尿病。 　　降糖效果不理想，我们认为主要是胰岛素分泌量不足。其原因可能是： 　　1、移植的细胞数量不足； 　　2、其次诱导时间不够长，诱导细胞未完全分化成熟； 　　3、将有限的诱导细胞移植至糖尿病鼠，长时间的接触高糖环境，影响诱导细胞的分泌功能，从而减弱了降糖反应能力。 　　诱导MSC向胰岛细胞分化需要进一步弄清胰腺及胰岛细胞的发育机制，诱导过程中如何合理使用需要的各种细胞因子、营养素，促进诱导细胞的成熟；了解掌握所诱导分化细胞胰岛素分泌量，选择足够量的移植细胞量也是有待解决的问题。

　　一、任务来源： 　　省卫生厅医学科研基金结转项目计划课题，吉卫指标函[2003]13号。 　　二、应用领域和技术原理： 　　用于治疗糖尿病探讨，如果利用体外诱导骨髓间充质干细胞产生胰岛素的β细胞治疗糖尿病得到肯定，将会造福于人类。 　　技术原理： 　　（一）骨髓间充质干细胞的分离培养、鉴定及生物学特征鉴定； 　　（二）鉴定骨髓间充质干细胞定向诱导分化特性； 　　（三）骨髓MSCs向胰岛样细胞分化、鉴定诱导分化细胞； 　　（四）制作糖尿病模型； 　　（五）移植诱导分化的胰岛细胞至糖尿病模型，观察治疗效果。 　　三、性能指标： 　　主要采用细胞和分子生物学及其他方法通过体内体外进行实验。培养诱导细胞转化，鉴定所诱导分化的细胞，并检测分化细胞的功能。 　　（一）动物及骨髓间充质干细胞的分离培养、鉴定及生物学特征鉴定： 　　1、流式细胞仪鉴定分离培养的细胞表面标记； 　　2、细胞纯化程度鉴定，证明所培养的细胞为均一的细胞。 　　（二）鉴定骨髓间充质干细胞定向诱导分化特性： 　　1、外骨髓MSCs分化成软骨细胞； 　　2、骨髓MSCs分化成脂肪细胞。 　　（三）正常胰岛细胞的培养与鉴定。 　　（四）骨髓间充质干细胞体外诱导分化胰岛细胞： 　　1、添加诱导因子进行诱导分化培养，分化细胞的筛选； 　　2、促进分化细胞成熟； 　　3、分化细胞的鉴定：通过细胞表面标志和组织化学方法进行鉴定。 　　（1）形态学观察； 　　（2）电镜观察； 　　（3）组织化学鉴定（双硫腙染色）； 　　（4）免疫细胞化学检测：鉴定胰岛素、胰岛素样生长因子抗原表达； 　　（5）Western blot检测胰岛素表达。 　　（五）骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛样细胞对坏死胰腺组织的修复： 　　1、骨髓单核细胞的制备； 　　2、胰腺坏死模型的制作； 　　3、实验组局部移植DAPI标记的已诱导的骨髓间充质干细胞，对照组移植骨髓单核细胞（5×106个细胞/100μL）。 　　（六）骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛样细胞对糖尿病大鼠的治疗作用： 　　1、大鼠糖尿病模型的制作： 　　使用链脲菌素（Streptozotocin，STZ）制作糖尿病模型（Wistar rat model of diabetes mellitus）； 　　2、大鼠糖尿病模型鉴定； 　　3、治疗效果移植诱导分化的胰岛细胞至糖尿病模型，观察治疗效果。 　　四、成果的创造性和先进性： 　　1、首次证明了诱导骨髓间充质干细胞转化为胰岛样细胞的培养体系（特异刺激因子）、程序及方法； 　　2、首次证实了诱导的胰岛样细胞可替代坏死胰腺组织，促进受体胰腺组织的修复，明显提高胰腺坏死大鼠的存活率； 　　3、首次证实了骨髓MSC诱导转化的胰岛样细胞移植可以降低糖尿病大鼠血糖、尿糖水平，改善糖尿病症状。并提出细胞移植可以替代、补充受体功能异常细胞的功能，还有可能使受体受损细胞功能恢复正常。 　　五、推广应用的范围、条件和前景以及存在的问题和改进意见： 　　该研究结果可应用于治疗糖尿病。 　　降糖效果不理想，我们认为主要是胰岛素分泌量不足。其原因可能是： 　　1、移植的细胞数量不足； 　　2、其次诱导时间不够长，诱导细胞未完全分化成熟； 　　3、将有限的诱导细胞移植至糖尿病鼠，长时间的接触高糖环境，影响诱导细胞的分泌功能，从而减弱了降糖反应能力。 　　诱导MSC向胰岛细胞分化需要进一步弄清胰腺及胰岛细胞的发育机制，诱导过程中如何合理使用需要的各种细胞因子、营养素，促进诱导细胞的成熟；了解掌握所诱导分化细胞胰岛素分泌量，选择足够量的移植细胞量也是有待解决的问题。