1、课题来源与背景：
课题来源于陕西省科学院青年基金。
抗菌肽(antimicrobial peptides)是具有抗菌活性短肽的总称。与青霉素等传统抗生素对细菌作用机制不同的是它的作用靶位是细菌细胞质膜,作用结果是使细菌细胞质膜通透性增大而导致细菌的死亡。因而成为新型抗菌药物的研究热点。
天蚕素B（cecropinB）是1975年瑞典科学家G.Boman等人等从惜古比天蚕蛹中诱导分离得到一种抗菌肽,它是天蚕类抗菌肽中作用最强的一种，成熟的肽由39个氨基酸组成，分子量约4kDa, 线型，分子内无二硫键，主要为螺旋构象，N端区带高度正电荷，C 端区带高度负电荷，具有双亲性，对G-和G+性菌均有较强的抗菌活性。
因为抗菌肽本身的天然产量很低,合成或从机体中提取的步骤复杂、产率低、成本高，所以利用基因工程技术生产抗菌肽具有重要意义。但是，抗菌肽分子对表达系统的宿主细胞具有毒性，因此，选择适合的表达形式和系统已成为实现抗菌肽能否广泛应用的关键性问题。
表皮生长因子（EGF）是20世纪60年代初美国科学家Cohen等人从小鼠颌下腺中分离纯化得到一种能促进表皮生长的蛋白。 成熟的人表皮生长因子是由53个氨基酸组成的单链多肽，链中含有6个半胱氨酸分子，形成3个稳定的二硫键，整条肽链为三个环联部分的活性物质。EGF是表皮细胞和间充质细胞的一种有效的促分裂剂，可促进外胚层细胞和毛细血管生长，促进表皮细胞生长繁殖，加速受伤表皮细胞的修复，还有抑制胃酸分泌等特殊的效果。因此，EGF在眼科、外科及胃肠道溃疡疾病的治疗上有很广的用途，另外，也可用于化妆品领域，起到延缓皮肤细胞衰老，使皮肤滋润光滑的作用。人表皮生长因子原是从尿液中提取出来的。由于原料收集困难，原料中有效成份含量低，提取工艺复杂等原因，人表皮生长因子的广泛应用受到了限制。
中科院上海生化与细胞研究所研制的酵母表达的人表皮生长获国家SFDA一类新药证书，用于促进伤口的愈合。
2、技术原理：
综上所述本项目用凝血酶酶切位点基因连接CecropinB与 人EGF基因片断，构建人EGF-CecropinB融合蛋白基因，使其在大肠杆菌中融合表达。表达成功后可解决以下技术问题：
(1)、解决CecropinB和人EGF蛋白分子在真核表达系统中产量低的问题。
(2)、解决CecropinB和人EGF蛋白分子单独表达纯化中存在的问题。CecropinB和人EGF肽分子量小，不易纯化，人EGF-CecropinB融合蛋白分子量较大，便于产物的纯化。
(3)、解决CecropinB在大肠杆菌的表达中对宿主菌的毒性问题。人EGF-CecropinB融合蛋白可以降低 CecropinB分子对表达系统的宿主细胞的毒性，有利于宿主细胞对目的蛋白的高表达。
(4)、药物可在损伤处自动活化。伤口处可以分泌凝血酶，切割人EGF-CecropinB融合蛋白的凝血酶切割位点，可使人EGF和CecropinB分子自动活化。
(5)、实现一种药物的双功能性：人EGF-CecropinB融合蛋白用于伤口的治疗时，人自身分泌的凝血酶可以自动切断人EGF-CecropinB融合蛋白，CecropinB分子和人EGF分子恢复原有的活性，使CecropinB和人EGF联合发挥自身作用。CecropinB可以杀死伤口处的耐药菌，人EGF可以促进伤口的愈合，防止疤痕的形成。
(6)、增加药物在体内的半衰期：CecropinB和人EGF均为小分子，在人体内的半衰期较短，人EGF-CecropinB融合蛋白分子量较大，可以增加药物在体内的半衰期，减少用药次数。
3、技术的创造性与先进性：
目前尚无天蚕素B与人表皮生长因子融合蛋白的研究。项目通过设计、改造并全基因合成了凝血酶切割位点基因连接的天蚕素B与人表皮生长因子融合蛋白基因；构建了能将此融合蛋白有效表达的工程菌；成功诱导了此融合蛋白，使其在原核表达系统中得到有效表达，融合蛋白表达量占菌体蛋白总量的10%。
4、技术成熟度：
本项目已实现了天蚕素B与人表皮生长因子融合蛋白在大肠杆菌中的融合表达，融合蛋白表达量占菌体蛋白总量的10%。在5升发酵罐中产量可达2g。具有一定的技术成熟度，达到国内领先水平。
5、应用情况：
本项目构建一种凝血酶切割位点连接的天蚕素B与人表皮生长因子融合蛋白，使其在大肠杆菌表达系统中得到有效表达。表达产物经纯化后可以应用于顽固性伤口的治疗和化妆品中疤痕的去除。
6、获奖情况：
无 |
