本项目对常规的组合性细胞因子诱导树突状细胞（DC）的表面标志与功能进行了研究，探索了钙离子载体（CI）在诱导外周血单个核细胞（Mo）、造血干细胞（HPC）及白血病细胞向DC分化中的作用及信号转导机制，先后涉及细胞培养技术、倒置显微镜下细胞形态观察、扫描电镜及透射电镜的标本制作、流式细胞仪检测技术、凝胶电泳迁移率变动分析（EMSA）方法检测细胞核转录因子κB（NF-κB）活性等细胞与分子免疫学方法进行研究，将体外培养的细胞进行形态观察、功能鉴定，最后进行肿瘤特异性杀伤试验，证实CI快速诱导DC分化的方法不但可以诱导Mo向DC的快速分化，还可以诱导未成熟的CD34+造血干细胞、幼稚的白血病细胞向DC的分化成熟。将HL-60及急慢性白血病患者的幼稚白血病细胞分别给予CI或组合性细胞因子（CK）包括GM-CSF、IL-4 和TNF- 刺激培养2周，发现在这2种条件下，幼稚的白血病细胞均可被诱导分化为DC样细胞，但CI诱导的DC表面CD80、CD86、CD83、CD40、CD54等分子的表达明显高于CK诱导者；CI所诱导的白血病细胞刺激混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction，MLR）的能力及激发细胞毒性T淋巴细胞（cytolytic T lymphocyte，CTL）的活力比CK诱导者强，诱导后的DC表面携带大量白血病抗原，可以激发白血病特异性抗肿瘤免疫。 　　为探讨CI诱导Mo分化为DC的信号转导途径，我们引入3种Ca2+/CaM活化途径的抑制剂（W-7、CsA、KT5926）进行研究。应用凝胶电泳迁移率变动分析（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）检测不同方法培养细胞的核转录因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）的活化水平，结果提示，由CI诱导Mo向DC分化的信号与细胞因子诱导者不同，主要与Ca2+/CaM信号转导途径有关；但不论其上游信号转导途径如何不同，CI及CK最终都通过激活NF-κB来诱导细胞的分化。 　　另我们从质粒p91023B-CEA-17酶切得到人全长CEA cDNA，经质粒pGEM7Zf(+)和pBluescript SK将全长CEA cDNA插入中间载体pJ -CEA（pJ-120）。143－TK细胞被野生型天坛株感染后，在培养基中加入Pj -CEA，通过脂质体共沉淀法进行基因同源重组，将CEA片段插入该病毒的TK片段，在含有Budr的培养液中，只有TK-的重组病毒才能繁殖，再用LacZ蓝斑进行双重选择，获得重组病毒－CEA。同时经细胞学及动物学试验证实可在真核系统高效表达，并经动物试验探讨了其安全性及免疫源性，经临床Ⅰ、Ⅱ期试验证实了其安全性。最后我们将肿瘤抗原基因CEA Cdna通过减毒的痘苗病毒载体转入DC，证实转染了Rv-CEA的DC表面高表达CEA抗原，灭活后可进一步诱导强大的抗CEA特异性免疫。另外用黑色素瘤患者的自体肿瘤抗原冲击致敏树突状细胞并体外诱导抗恶性黑色素瘤免疫。 　　树突状细胞（dendritic cells，DC）是免疫系统中一类最主要的抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）。DC富含主要组织相容性抗原I、II以及细胞间黏附分子、共刺激分子，可激活初始的T细胞或记忆性T细胞，是启动、调控并维持免疫应答的中心环节。因此，探讨DC的分化成熟过程、功能特点及临床应用具有重要意义。传统DC的培养方法存在培养时间长、成本高、获得的DC表面共刺激分子、黏附分子及某些有利于抗原呈递的分子的表达太少甚至缺乏等缺点，结果阻碍有关DC的实验室及临床研究。本研究系列发现了钙离子载体（CI）能快速诱导外周血单核细胞、造血干细胞及幼稚的白血病细胞向DC的分化，解决了传统组合性细胞因子培养中存在的主要问题，对DC的基础研究及临床应用具有重要意义。另白血病、恶性黑色素瘤及癌胚抗原（CEA）分泌性肿瘤等恶性肿瘤的发病率高，目前治疗方法主要有早期发现后手术切除或放化疗治疗，但不能完全消灭残存的肿瘤细胞，故复发率高，严重影响上述肿瘤患者的生存率及治愈率。该研究系列证实CEA重组痘苗病毒转染DC、恶性黑色素瘤患者的自体肿瘤疫苗冲击致敏的DC以及白血病诱导分化后的DC疫苗，与手术、放化疗等治疗手段结合，可以延长患者的生存时间，提高患者的治愈率，为上述肿瘤患者的治疗带来了新的希望，因此具有广阔的应用前景。

　　本项目对常规的组合性细胞因子诱导树突状细胞（DC）的表面标志与功能进行了研究，探索了钙离子载体（CI）在诱导外周血单个核细胞（Mo）、造血干细胞（HPC）及白血病细胞向DC分化中的作用及信号转导机制，先后涉及细胞培养技术、倒置显微镜下细胞形态观察、扫描电镜及透射电镜的标本制作、流式细胞仪检测技术、凝胶电泳迁移率变动分析（EMSA）方法检测细胞核转录因子κB（NF-κB）活性等细胞与分子免疫学方法进行研究，将体外培养的细胞进行形态观察、功能鉴定，最后进行肿瘤特异性杀伤试验，证实CI快速诱导DC分化的方法不但可以诱导Mo向DC的快速分化，还可以诱导未成熟的CD34+造血干细胞、幼稚的白血病细胞向DC的分化成熟。将HL-60及急慢性白血病患者的幼稚白血病细胞分别给予CI或组合性细胞因子（CK）包括GM-CSF、IL-4 和TNF- 刺激培养2周，发现在这2种条件下，幼稚的白血病细胞均可被诱导分化为DC样细胞，但CI诱导的DC表面CD80、CD86、CD83、CD40、CD54等分子的表达明显高于CK诱导者；CI所诱导的白血病细胞刺激混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction，MLR）的能力及激发细胞毒性T淋巴细胞（cytolytic T lymphocyte，CTL）的活力比CK诱导者强，诱导后的DC表面携带大量白血病抗原，可以激发白血病特异性抗肿瘤免疫。 　　为探讨CI诱导Mo分化为DC的信号转导途径，我们引入3种Ca2+/CaM活化途径的抑制剂（W-7、CsA、KT5926）进行研究。应用凝胶电泳迁移率变动分析（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）检测不同方法培养细胞的核转录因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）的活化水平，结果提示，由CI诱导Mo向DC分化的信号与细胞因子诱导者不同，主要与Ca2+/CaM信号转导途径有关；但不论其上游信号转导途径如何不同，CI及CK最终都通过激活NF-κB来诱导细胞的分化。 　　另我们从质粒p91023B-CEA-17酶切得到人全长CEA cDNA，经质粒pGEM7Zf(+)和pBluescript SK将全长CEA cDNA插入中间载体pJ -CEA（pJ-120）。143－TK细胞被野生型天坛株感染后，在培养基中加入Pj -CEA，通过脂质体共沉淀法进行基因同源重组，将CEA片段插入该病毒的TK片段，在含有Budr的培养液中，只有TK-的重组病毒才能繁殖，再用LacZ蓝斑进行双重选择，获得重组病毒－CEA。同时经细胞学及动物学试验证实可在真核系统高效表达，并经动物试验探讨了其安全性及免疫源性，经临床Ⅰ、Ⅱ期试验证实了其安全性。最后我们将肿瘤抗原基因CEA Cdna通过减毒的痘苗病毒载体转入DC，证实转染了Rv-CEA的DC表面高表达CEA抗原，灭活后可进一步诱导强大的抗CEA特异性免疫。另外用黑色素瘤患者的自体肿瘤抗原冲击致敏树突状细胞并体外诱导抗恶性黑色素瘤免疫。 　　树突状细胞（dendritic cells，DC）是免疫系统中一类最主要的抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）。DC富含主要组织相容性抗原I、II以及细胞间黏附分子、共刺激分子，可激活初始的T细胞或记忆性T细胞，是启动、调控并维持免疫应答的中心环节。因此，探讨DC的分化成熟过程、功能特点及临床应用具有重要意义。传统DC的培养方法存在培养时间长、成本高、获得的DC表面共刺激分子、黏附分子及某些有利于抗原呈递的分子的表达太少甚至缺乏等缺点，结果阻碍有关DC的实验室及临床研究。本研究系列发现了钙离子载体（CI）能快速诱导外周血单核细胞、造血干细胞及幼稚的白血病细胞向DC的分化，解决了传统组合性细胞因子培养中存在的主要问题，对DC的基础研究及临床应用具有重要意义。另白血病、恶性黑色素瘤及癌胚抗原（CEA）分泌性肿瘤等恶性肿瘤的发病率高，目前治疗方法主要有早期发现后手术切除或放化疗治疗，但不能完全消灭残存的肿瘤细胞，故复发率高，严重影响上述肿瘤患者的生存率及治愈率。该研究系列证实CEA重组痘苗病毒转染DC、恶性黑色素瘤患者的自体肿瘤疫苗冲击致敏的DC以及白血病诱导分化后的DC疫苗，与手术、放化疗等治疗手段结合，可以延长患者的生存时间，提高患者的治愈率，为上述肿瘤患者的治疗带来了新的希望，因此具有广阔的应用前景。