本项研究是通过收集筛选汉族和少数民族血样总共约25万份，经血清学方法确认，获得各种RhD表型变异体后，对RHD基因进行分子生物学分析。整个项目除按时完成了任务书中的计划研究内容之外，进一步地对RHD基因的转录、RHD boxes和RhD的表达与Rh复合体附属蛋白之间的关系作了初步探索。通过本项研究，我们在中国人群中共发现27种RHD等位基因。其中12种是新发现的RHD等位基因。 一、中国人群中的RhD阳性 按D抗原表达的量和表达的方式可将RhD阳性可分为正常表达D、弱表达D、部分D(缺失9种D表位中的一种或几种)和超量表达D。由于常规的血清学筛选无法区别正常的D和超量的D。因此本项研究中未包含对超量D的测定。 1、中国人群中RhD抗原频率的调查 本项目通过血清学方法，筛选鉴定了共44万人次的RhD抗原。发现中国 Rh阴性的频率由南向北逐步升高(0.24%至0.45%)，全国Rh阴性频率最高为新彊地区少数民族（4.5%）。在云南怒族的小样本调查中（127人）发现Rh阴性频率为4.7%。 2、表达弱D表型的RHD等位基因，中国人与白种人和黑人完全不同 弱D表型是指红细胞上RhD抗原表达减弱(一般只有正常D1/4表达量)。中国人群中RhD阳性可达99.6%，按我们平时进行血型鉴定的经验，在这99.6%的D阳性中是存在一定比例的弱凝集样本。因此，我们将这些弱凝集样本经RhD表位分析和抗D吸收和放散试验，排除常见部分D表型和Del表型。共获得38例弱D表型样本。对以上样本RHD 1-10外显子全长测序。按先前报道[2]，另设计PCR-SSP方法特异性扩增中国人群中常见的弱D 15基因型（RHD(G282D)），排除弱D 15型。共获得17例弱D 15，2例弱D 25，弱D 5、弱D 6和弱D 33，4例新发现等位基因，分别为：C165T、C365t、G960A、C1212A，前三种新等位基因分别获得Genbank号如下DQ309583、DQ869864、DQ874619，C1212A目前正在申请Genbank号。在白种人中弱D主要是弱D1，其频率与所有弱D的。而在我们中国人的弱D中弱D15占44.7%。此外，中国人群中的弱D有30%为新的弱D等位基因所编码。在本项研究中所发现的新弱D等位基因占目前所发现的所有弱D等位基因的9%。[3] 3、RHD Del是黄种人(中国人群)与其它人种区别最大的RH等位基因 白种人和黑人中很少存在RHD Del等位基因。在本项研究中，我们收集上海地区随机健康Rh阴性献血者血样1337例。通过吸收放散试验共筛出Del 238例，提示在上海Rh阴性人群中，Del比例为17.80%。所有Del标本经多重PCR检测显示均具有基本完整的RHD基因。序列特异性引物PCR（PCR-SSP）筛查最常见的Del等位基因RHD（K409K），RHD（M295I）后，对于可能存在新等位基因的样品通过测序分析。结果表明：97.48%的中国Del（232例）具有RHD(K409K)等位基因，无1例样品具有RHD（M295I）等位基因。6例未测得RHD（K409K），RHD（M295I）的样品经测序发现，2例具有RHD 3G→A 突变（GenBank DQ310735），1例RHD 28C→T突变（DQ534023）， 1例RHD 53T→C突变（GenBank DQ451877、DQ451878），1例RHD 251T→C突变（GenBank DQ310734），1例RHD 410 C→A突变（DQ534022）。 用上述同样的方法，对86例新疆维族Rh阴性进行的Del调查，发现Del在维族中的频率（2.3%），而且也是RHD (K409K)等位基因。其Del的频率明显低于汉族(17.8%)，但高于白种人。 本项研究显示，中国大陆人群中至少存在七种Del表型不同的等位基因，加上台湾发现的缺失外显子9的RHD(delEx9)，在中国人中发现的Del占所有巳发现的18种Del等位基因的44%[3]。除RHD(K409K)和RHD(delEx9)是剪切突变外，其它所有这六种Del等位基因皆为单个碱基突变而导致氨基酸置换。而由RHD(K409K)等位基因引起的Del表型是中国人群中常见的D变异型。 二、中国人群中的Rh阴性 1、RHD基因缺失 由RHD基因缺失而导致红细胞膜上无RhD抗原的表达具中国人群中最常见的Rh阴表型，占所有Rh阴性的79.1%。这些表型绝大部分为ccdee(66.3%)，但也可为Ccdee(10.4%)、ccdEe(1.8%)以及CCdee(0.6%)。采用单克隆抗D、抗带3和抗CD47经流式测定Rh阴性红细胞膜上RhD、带3和CD47的荧光强度，发现Rh阴性红细胞上带3表达正常，但CD47表达下降。与发现的Rhnull红细胞上CD47下降85%的结果相比较，提示当RhD，RhCE(RH30)和RhAG(RH50)在红细胞膜上都不表达时，Rh复合体中附属蛋白的表达会受较大影响。而当只有部分RH30不表达时，对复合体中的属蛋白表达的影响降低。 2、Rh阴性中带有的RHD基因分析 所谓Rh阴性中的RHD基因是指存在于亚洲人群中的一种Rh血型特殊的现象。这些个体的红细胞上不存在RhD蛋白，但在其基因组DNA上确存在完整的RHD基因。前几年在日本、台湾的学者报道的情况中，我们经过分析测定并不具中国人群中主要的造成这种有基因不表达的原因。在本项研究中，我们将复检Rh阴性献血者血样经IgM抗-D试剂初筛，人源和单克隆IgG抗-D排除弱D和部分D，人源IgG抗-D吸收放散排除Del表型，共获得376例Rh阴性表型样本。经多重PCR分析，11例为含多个RHD特异性外显子样本。经中国人群部分突变的Rh阴性基因型PCR-SSP分析（如RHD(del711)），其中5例为RHD(del711)，进一步用克隆和测序的方法分析这些样本在gDNA上的核酸突变，发现二种新的Rh阴性形成机制，由intron2 +1 G->A 点突变，exon2中325A deletion移码突变；1例为新的杂交基因类型D(1-2)-CE(3)-D(4-10)，其余4例未完成全部exon测序。在用RHD-specific exon 1， exon 10， intron 2 PCR-SSP对163例Rh阴性进行Rh杂合基因分析中发现，中国Rh阴性人群中Rh杂合基因主要是RHD(1)-CE(2-9)-D(10)，占所有Rh阴性的15.9%。其它杂合基因包含RHD(1)-CE(2-10)占所有Rh阴性表型的0.6%。 三、RHD基因的转录分析证实RHD只在红系中转录 为了分析红系细胞和非红系细胞RHD的转录情况，同时进一步比较不同D表达个体的RHD的转录关系。我们采用RT-PCR检测HL-60、K562、Jurkat、THP-1、HECF、12名不同Rh表型个体的网织红细胞（3名CcDEe、2名CCDEe、2名CCDee，2名CcDee，3名CCDuee）、以及10名不同Rh表型（2 CCDEe、2 CCDee、2 ccDee、2 CcDee、ccDEe和CcDEe）个体的RhD mRNA，结果显示除红系细胞外，其它细胞皆不存在RhD mRNA。K562具有一个正常的RHD基因转录本，而不同表型个体的红细胞中每一个都具有复杂的RhD cDNA形式。cDNA克隆并测序表明，截短的mRNA包括缺少RHD基因的外显子7、缺少外显子7～9或外显子4～9等多种形式。但这些个体都有一个正常形式的RhD mRNA[5]。目前我们尚不清楚在同一个体中产生如此多的不同mRNA剪切本的原因与意义。 四、RHD基因的表达会影响RH复合体中CD47的表达 在本项研究中，我们用单抗结合红细胞上相应抗原后，通过流式分析不同RhD变异体红细胞上带3和CD47表达的量。发现当RhD的荧光强度下降5O.7%时，CD47也同时下降62.6%，但相同条件下带3的荧光强度无变化。此结果进一步证实了的观点[6]，不仅是在Rh30和Rh50同时在红细胞膜上缺失时，Rh复合体中的附属蛋白的表达会受影响，单一的RhD蛋白表达下降时，部分附属蛋白的表达也会下调。 五、本项研究中的其它发现 1 中国人群的RhD阴性中不存在RHDΨ RHDΨ是RHD基因内含子3与外显子4之间插入了一段37bp的DNA。60%的RhD阴性黑人是RHDΨ等位基因。但是在中国人中我们未发现有RHDΨ的存在。 2 中国人群RH boxes 中可能存在较多的基因多态性 RHD上下游都有一个约9 Kb 的同源性极高的RH boxes。当RHD缺失时，上下游的boxes形成一个杂交boxes。当我们用长矩PCR、PCR-SSP结合PCR-RFLP分析弱D的RHD基因杂合性时，发现约40%的个体未检出预期杂交boxes。同样的倩况也在非洲族人中发现[7]。提示中国人Rh boxes中可能存在多态性。 六、RHD基因诊断的临床应用 1、Rh新生儿溶血病的预判。 通过测定母体外周血中胎儿DNA RHD基因，预判胎儿Rh血型。该技术在首先排除孕妇血浆DNA中的RhD基因片段来自母亲本身之后，应用TaqMan探针进行Real Time PCR检测孕妇血浆中是否存在RHD特异性外显子片段，以判别胎儿RhD血型。经9例临床预判，符合率100%。 2、适用于中国人群的RHD基因诊断试剂盒。

本项研究是通过收集筛选汉族和少数民族血样总共约25万份，经血清学方法确认，获得各种RhD表型变异体后，对RHD基因进行分子生物学分析。整个项目除按时完成了任务书中的计划研究内容之外，进一步地对RHD基因的转录、RHD boxes和RhD的表达与Rh复合体附属蛋白之间的关系作了初步探索。通过本项研究，我们在中国人群中共发现27种RHD等位基因。其中12种是新发现的RHD等位基因。 一、中国人群中的RhD阳性 按D抗原表达的量和表达的方式可将RhD阳性可分为正常表达D、弱表达D、部分D(缺失9种D表位中的一种或几种)和超量表达D。由于常规的血清学筛选无法区别正常的D和超量的D。因此本项研究中未包含对超量D的测定。 1、中国人群中RhD抗原频率的调查 本项目通过血清学方法，筛选鉴定了共44万人次的RhD抗原。发现中国 Rh阴性的频率由南向北逐步升高(0.24%至0.45%)，全国Rh阴性频率最高为新彊地区少数民族（4.5%）。在云南怒族的小样本调查中（127人）发现Rh阴性频率为4.7%。 2、表达弱D表型的RHD等位基因，中国人与白种人和黑人完全不同 弱D表型是指红细胞上RhD抗原表达减弱(一般只有正常D1/4表达量)。中国人群中RhD阳性可达99.6%，按我们平时进行血型鉴定的经验，在这99.6%的D阳性中是存在一定比例的弱凝集样本。因此，我们将这些弱凝集样本经RhD表位分析和抗D吸收和放散试验，排除常见部分D表型和Del表型。共获得38例弱D表型样本。对以上样本RHD 1-10外显子全长测序。按先前报道[2]，另设计PCR-SSP方法特异性扩增中国人群中常见的弱D 15基因型（RHD(G282D)），排除弱D 15型。共获得17例弱D 15，2例弱D 25，弱D 5、弱D 6和弱D 33，4例新发现等位基因，分别为：C165T、C365t、G960A、C1212A，前三种新等位基因分别获得Genbank号如下DQ309583、DQ869864、DQ874619，C1212A目前正在申请Genbank号。在白种人中弱D主要是弱D1，其频率与所有弱D的。而在我们中国人的弱D中弱D15占44.7%。此外，中国人群中的弱D有30%为新的弱D等位基因所编码。在本项研究中所发现的新弱D等位基因占目前所发现的所有弱D等位基因的9%。[3] 3、RHD Del是黄种人(中国人群)与其它人种区别最大的RH等位基因 白种人和黑人中很少存在RHD Del等位基因。在本项研究中，我们收集上海地区随机健康Rh阴性献血者血样1337例。通过吸收放散试验共筛出Del 238例，提示在上海Rh阴性人群中，Del比例为17.80%。所有Del标本经多重PCR检测显示均具有基本完整的RHD基因。序列特异性引物PCR（PCR-SSP）筛查最常见的Del等位基因RHD（K409K），RHD（M295I）后，对于可能存在新等位基因的样品通过测序分析。结果表明：97.48%的中国Del（232例）具有RHD(K409K)等位基因，无1例样品具有RHD（M295I）等位基因。6例未测得RHD（K409K），RHD（M295I）的样品经测序发现，2例具有RHD 3G→A 突变（GenBank DQ310735），1例RHD 28C→T突变（DQ534023）， 1例RHD 53T→C突变（GenBank DQ451877、DQ451878），1例RHD 251T→C突变（GenBank DQ310734），1例RHD 410 C→A突变（DQ534022）。 用上述同样的方法，对86例新疆维族Rh阴性进行的Del调查，发现Del在维族中的频率（2.3%），而且也是RHD (K409K)等位基因。其Del的频率明显低于汉族(17.8%)，但高于白种人。 本项研究显示，中国大陆人群中至少存在七种Del表型不同的等位基因，加上台湾发现的缺失外显子9的RHD(delEx9)，在中国人中发现的Del占所有巳发现的18种Del等位基因的44%[3]。除RHD(K409K)和RHD(delEx9)是剪切突变外，其它所有这六种Del等位基因皆为单个碱基突变而导致氨基酸置换。而由RHD(K409K)等位基因引起的Del表型是中国人群中常见的D变异型。 二、中国人群中的Rh阴性 1、RHD基因缺失 由RHD基因缺失而导致红细胞膜上无RhD抗原的表达具中国人群中最常见的Rh阴表型，占所有Rh阴性的79.1%。这些表型绝大部分为ccdee(66.3%)，但也可为Ccdee(10.4%)、ccdEe(1.8%)以及CCdee(0.6%)。采用单克隆抗D、抗带3和抗CD47经流式测定Rh阴性红细胞膜上RhD、带3和CD47的荧光强度，发现Rh阴性红细胞上带3表达正常，但CD47表达下降。与发现的Rhnull红细胞上CD47下降85%的结果相比较，提示当RhD，RhCE(RH30)和RhAG(RH50)在红细胞膜上都不表达时，Rh复合体中附属蛋白的表达会受较大影响。而当只有部分RH30不表达时，对复合体中的属蛋白表达的影响降低。 2、Rh阴性中带有的RHD基因分析 所谓Rh阴性中的RHD基因是指存在于亚洲人群中的一种Rh血型特殊的现象。这些个体的红细胞上不存在RhD蛋白，但在其基因组DNA上确存在完整的RHD基因。前几年在日本、台湾的学者报道的情况中，我们经过分析测定并不具中国人群中主要的造成这种有基因不表达的原因。在本项研究中，我们将复检Rh阴性献血者血样经IgM抗-D试剂初筛，人源和单克隆IgG抗-D排除弱D和部分D，人源IgG抗-D吸收放散排除Del表型，共获得376例Rh阴性表型样本。经多重PCR分析，11例为含多个RHD特异性外显子样本。经中国人群部分突变的Rh阴性基因型PCR-SSP分析（如RHD(del711)），其中5例为RHD(del711)，进一步用克隆和测序的方法分析这些样本在gDNA上的核酸突变，发现二种新的Rh阴性形成机制，由intron2 +1 G->A 点突变，exon2中325A deletion移码突变；1例为新的杂交基因类型D(1-2)-CE(3)-D(4-10)，其余4例未完成全部exon测序。在用RHD-specific exon 1， exon 10， intron 2 PCR-SSP对163例Rh阴性进行Rh杂合基因分析中发现，中国Rh阴性人群中Rh杂合基因主要是RHD(1)-CE(2-9)-D(10)，占所有Rh阴性的15.9%。其它杂合基因包含RHD(1)-CE(2-10)占所有Rh阴性表型的0.6%。 三、RHD基因的转录分析证实RHD只在红系中转录 为了分析红系细胞和非红系细胞RHD的转录情况，同时进一步比较不同D表达个体的RHD的转录关系。我们采用RT-PCR检测HL-60、K562、Jurkat、THP-1、HECF、12名不同Rh表型个体的网织红细胞（3名CcDEe、2名CCDEe、2名CCDee，2名CcDee，3名CCDuee）、以及10名不同Rh表型（2 CCDEe、2 CCDee、2 ccDee、2 CcDee、ccDEe和CcDEe）个体的RhD mRNA，结果显示除红系细胞外，其它细胞皆不存在RhD mRNA。K562具有一个正常的RHD基因转录本，而不同表型个体的红细胞中每一个都具有复杂的RhD cDNA形式。cDNA克隆并测序表明，截短的mRNA包括缺少RHD基因的外显子7、缺少外显子7～9或外显子4～9等多种形式。但这些个体都有一个正常形式的RhD mRNA[5]。目前我们尚不清楚在同一个体中产生如此多的不同mRNA剪切本的原因与意义。 四、RHD基因的表达会影响RH复合体中CD47的表达 在本项研究中，我们用单抗结合红细胞上相应抗原后，通过流式分析不同RhD变异体红细胞上带3和CD47表达的量。发现当RhD的荧光强度下降5O.7%时，CD47也同时下降62.6%，但相同条件下带3的荧光强度无变化。此结果进一步证实了的观点[6]，不仅是在Rh30和Rh50同时在红细胞膜上缺失时，Rh复合体中的附属蛋白的表达会受影响，单一的RhD蛋白表达下降时，部分附属蛋白的表达也会下调。 五、本项研究中的其它发现 1 中国人群的RhD阴性中不存在RHDΨ RHDΨ是RHD基因内含子3与外显子4之间插入了一段37bp的DNA。60%的RhD阴性黑人是RHDΨ等位基因。但是在中国人中我们未发现有RHDΨ的存在。 2 中国人群RH boxes 中可能存在较多的基因多态性 RHD上下游都有一个约9 Kb 的同源性极高的RH boxes。当RHD缺失时，上下游的boxes形成一个杂交boxes。当我们用长矩PCR、PCR-SSP结合PCR-RFLP分析弱D的RHD基因杂合性时，发现约40%的个体未检出预期杂交boxes。同样的倩况也在非洲族人中发现[7]。提示中国人Rh boxes中可能存在多态性。 六、RHD基因诊断的临床应用 1、Rh新生儿溶血病的预判。 通过测定母体外周血中胎儿DNA RHD基因，预判胎儿Rh血型。该技术在首先排除孕妇血浆DNA中的RhD基因片段来自母亲本身之后，应用TaqMan探针进行Real Time PCR检测孕妇血浆中是否存在RHD特异性外显子片段，以判别胎儿RhD血型。经9例临床预判，符合率100%。 2、适用于中国人群的RHD基因诊断试剂盒。