(1)任务来源：面上项目，编号PW2005A-18。 (2)应用领域和技术原理： TAMP12基因的肿瘤表达谱分析 TAMP12是通过SEREX技术从人卵巢癌cDNA文库中筛选得到的新基因，要明确其肿瘤抗原基因属性必须进一步确定其在人体其它类型的肿瘤以及在正常组织中的表达情况。为此利用Real-time PCR和Northern blot技术检测了TAMP12 mRNA在多种正常组织和肿瘤组织以及肿瘤细胞株中的表达。这为将TAMP12基因（蛋白）用于筛选肿瘤奠定了理论依据。 TAMP12基因的原核表达、鉴定、TAMP12多克隆抗体制备和纯化为了进一步对TAMP12基因功能进行研究，我们从人睾丸组织中克隆TAMP12基因，并构建到原核表达载体pET28a中，进行蛋白表达，Ni2+亲和层析纯化后免疫家兔制备了相应抗TAMP12的多克隆抗体。兔抗血清应用A蛋白吸附法纯化后，经检测其效价达1：106。为进一步弄清这一基因及表达蛋白功能提供了实验研究基础。 TAMP12多克隆抗体的临床初步应用 应用上述纯化抗原和抗体，我们分别用免疫组化法和ELISA法检测了正常人和肿瘤患者组织、血清和细胞中TAMP12抗原（或抗体）的表达情况，免疫组化结果显示TAMP12抗原在肝癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌和肾癌等肿瘤组织中高表达，而且癌症恶性程度越高，侵袭性越强，TAMP12抗原表达越高。以TAMP12抗原包被的ELISA板检测48例正常人血清及113例各种肿瘤患者血清中TAMP12抗体水平，结果经统计后发现，正常人组OD均值为0.17±0.07，肿瘤病人组OD均值为0.32±0.15，两组有显著的统计学意义（p<0.0001），以大于正常人组OD值＋2SD作为界值，113例肿瘤患者中有46例为阳性。以上结果提示TAMP12是一种潜在的肿瘤相关抗原，为进一步深入研究TAMP12蛋白及其抗体应用于临床肿瘤的辅助诊断奠定可靠基础。 (3)性能指标(写明合同要求的主要性能指标和实际达到的性能指标)： 主要性能指标：1. 建立稳定的TAMP12蛋白免疫组化分析和抗体ELISA的检测法2. 完成高质量论文1-2篇。 实际达到的性能指标：1. 在样本数161例基础上， 建立稳定的TAMP12蛋白免疫组化分析和抗体ELISA的检测法，本课题已于2007年10月结题，完成学术论文1篇，待发表。2. 结题后课题报新区科研成果评审，验收。 (4)与国内外同类技术比较：寻找新的肿瘤抗原基因、抗原，分析其蛋白功能和致瘤机制，仍是当前肿瘤免疫学研究的核心问题，也是临床应用中提高肿瘤诊断阳性率和发展肿瘤防治的关键。肿瘤患者血清中肿瘤相关抗原和相应抗体的检测是当前临床肿瘤诊断和治疗中的一个重要辅助手段。目前临床上用于辅助检测的标记物甚多，包括肿瘤相关抗原如CA125、CA199、CEA、AFP、TPA等等，此外还有一些分子遗传标记物如Ras、p53抑癌基因、C-erb2和Bc1-2以及一些分子分化蛋白标记物如Ki-67等，其中一些标记物对于监视肿瘤的发生，化疗敏感性和手术预后判断都具有一定意义。同时发现肿瘤患者血清中检测到大量针对肿瘤特异性或相关性抗原的自身抗体，如针对p53突变基因、Mucin、Her-2/neu等的抗体。但是这些，这些标记物对肿瘤检测的特异性和灵敏度目前仍不能满足临床需要，这些肿瘤抗原自身抗体在临床上的真正意义有待于进一步深入研究，包括这些抗体的产生和肿瘤的病理分类和病理阶段、肿瘤的早期诊断和预后、肿瘤的转移、患者的术后生存率和死亡率、以及其与目前常用于检测肿瘤的标记物之间的关系等等诸多问题，至今仍未获得满意的结果。 1995年，Sahin首次报道应用重组cDNA表达文库血清分析法（serological analysis of recombinant cDNA expression libraries， SEREX）筛选肿瘤抗原基因编码蛋白，即以肿瘤患者自体血清中高滴度的抗体为探针，从cDNA表达文库中筛选得到阳性克隆，通过组织表达谱的分析，明确表达蛋白的免疫生物学特征。最近，协作单位（上海市免疫学研究所）应用SEREX法筛选了自行构建的人卵巢癌cDNA表达文库，获得多个cDNA阳性克隆，经组织表达谱初步测定和序列分析，发现一个新基因位于人染色体9q34.3，长度345bp，编码114个氨基酸，蛋白分子量12KD左右，等电点为8.93，利用生物学信息网络预测发现该蛋白含有线粒体定向序列，并经绿色荧光融合蛋白转入COS-7细胞中，在共聚焦显微镜下发现细胞核外分布许多荧光点，位置和线粒体位置相似，并通过线粒体特异性探针加以证实。根据这一蛋白初步的免疫学特性和亚细胞定位，将其命名为肿瘤抗原-线粒体蛋白12（TAMP12）。Northern blot和免疫组化法分析在某些肿瘤细胞株和组织中，TAM12 mRNA和蛋白均高表达，因而提示发现TAM12是一种广泛的具有免疫原性的肿瘤特异性抗原，初步实验结果表明肿瘤患者外周血中TAM12自身抗体的检出率大大高于正常人群组，显示TAM12可以有效激发机体的免疫应答。同时提示TAM12及其自身抗体可能作为新的肿瘤标记物，其在肿瘤的临床诊断、预后判断中具有潜在的应用价值。 我们分别用免疫组化法和ELISA法检测了正常人和肿瘤患者组织、血清和细胞中TAMP12抗原（或抗体）的表达情况，免疫组化结果显示TAMP12抗原在肝癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌和肾癌等肿瘤组织中高表达，而且癌症恶性程度越高，侵袭性越强，TAMP12抗原表达越高。以TAMP12抗原包被的ELISA板检测48例正常人血清及113例各种肿瘤患者血清中TAMP12抗体水平，结果经统计后发现，正常人组OD均值为0.17±0.07，肿瘤病人组OD均值为0.32±0.15，两组有显著的统计学意义（p<0.0001），以大于正常人组OD值＋2SD作为界值，113例肿瘤患者中有46例为阳性。以上结果提示TAMP12是一种潜在的肿瘤相关抗原，为进一步深入研究TAMP12蛋白及其抗体应用于临床肿瘤的辅助诊断奠定可靠基础。 (5)成果的创造性、先进性：寻找新的肿瘤特异性或相关型标志物是肿瘤临床诊断、治疗和术后跟踪的重要辅助手段。本项目以基础研究结合临床应用，收集了多种临床肿瘤标本，初步建立了测定TAMP12抗原和特异性抗体的实验方法，并在正常人和肿瘤患者中显示存在显著差异，表明TAMP12抗原（或抗体）与肿瘤存在相关性，这为发展肿瘤特异性诊断试剂盒奠定了基础。 (6)作用意义（直接经济效益和社会意义）：拟在该基因克隆、原核表达以及肿瘤表达谱分析等上述工作基础上，建立TAM12蛋白免疫组织化学分析法和TAM12抗体的ELISA检测试剂盒，通过收集大量临床上正常、良性和肿瘤患者血清，探讨TAM12抗原和血清抗体的定量检测与其他肿瘤标记物的关系，以及与肿瘤病理类型和恶性程度的相互关系，为肿瘤的临床诊断和防治提供新的标记物和有效手段。继续申请资助深入研究，从事试剂盒试制，质量控制考核，扩大样品检测，逐步过渡于临床的常规肿瘤辅助诊断应用。预期可能产生一定的经济和社会效益。 (7)存在的问题和改进意见：存在的问题：1.本研究采用试验方法为免疫组织化学方法，该方法是基于蛋白水平的检测，并且对某些操作环节的技术要求较高，如切片的制作，开始制作的切片无法达到实验的要求，后多次改进；在实验环节上也存在不足，如标本的保存，要求及时留取标本，尽可能的保留标本的理化特性，但由于实际工作的困难，留取标本置入超低温环境间隔时间较长，导致标本理化特性下降，所以为了保证实验的严谨性，早期一批标本只好舍弃，这无疑延长了实验周期。2.由于课题时间相对短，同时二级医院部分病例数相对较少的原因，研究样本量相对较小，结果可能出现统计学偏差。 改进意见：1.扩大样本数量，减少统计学偏差。2.严把各个环节质量，减少误差，缩短实验时间。

(1)任务来源：面上项目，编号PW2005A-18。 (2)应用领域和技术原理： TAMP12基因的肿瘤表达谱分析 TAMP12是通过SEREX技术从人卵巢癌cDNA文库中筛选得到的新基因，要明确其肿瘤抗原基因属性必须进一步确定其在人体其它类型的肿瘤以及在正常组织中的表达情况。为此利用Real-time PCR和Northern blot技术检测了TAMP12 mRNA在多种正常组织和肿瘤组织以及肿瘤细胞株中的表达。这为将TAMP12基因（蛋白）用于筛选肿瘤奠定了理论依据。 TAMP12基因的原核表达、鉴定、TAMP12多克隆抗体制备和纯化为了进一步对TAMP12基因功能进行研究，我们从人睾丸组织中克隆TAMP12基因，并构建到原核表达载体pET28a中，进行蛋白表达，Ni2+亲和层析纯化后免疫家兔制备了相应抗TAMP12的多克隆抗体。兔抗血清应用A蛋白吸附法纯化后，经检测其效价达1：106。为进一步弄清这一基因及表达蛋白功能提供了实验研究基础。 TAMP12多克隆抗体的临床初步应用 应用上述纯化抗原和抗体，我们分别用免疫组化法和ELISA法检测了正常人和肿瘤患者组织、血清和细胞中TAMP12抗原（或抗体）的表达情况，免疫组化结果显示TAMP12抗原在肝癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌和肾癌等肿瘤组织中高表达，而且癌症恶性程度越高，侵袭性越强，TAMP12抗原表达越高。以TAMP12抗原包被的ELISA板检测48例正常人血清及113例各种肿瘤患者血清中TAMP12抗体水平，结果经统计后发现，正常人组OD均值为0.17±0.07，肿瘤病人组OD均值为0.32±0.15，两组有显著的统计学意义（p<0.0001），以大于正常人组OD值＋2SD作为界值，113例肿瘤患者中有46例为阳性。以上结果提示TAMP12是一种潜在的肿瘤相关抗原，为进一步深入研究TAMP12蛋白及其抗体应用于临床肿瘤的辅助诊断奠定可靠基础。 (3)性能指标(写明合同要求的主要性能指标和实际达到的性能指标)： 主要性能指标：1. 建立稳定的TAMP12蛋白免疫组化分析和抗体ELISA的检测法2. 完成高质量论文1-2篇。 实际达到的性能指标：1. 在样本数161例基础上， 建立稳定的TAMP12蛋白免疫组化分析和抗体ELISA的检测法，本课题已于2007年10月结题，完成学术论文1篇，待发表。2. 结题后课题报新区科研成果评审，验收。 (4)与国内外同类技术比较：寻找新的肿瘤抗原基因、抗原，分析其蛋白功能和致瘤机制，仍是当前肿瘤免疫学研究的核心问题，也是临床应用中提高肿瘤诊断阳性率和发展肿瘤防治的关键。肿瘤患者血清中肿瘤相关抗原和相应抗体的检测是当前临床肿瘤诊断和治疗中的一个重要辅助手段。目前临床上用于辅助检测的标记物甚多，包括肿瘤相关抗原如CA125、CA199、CEA、AFP、TPA等等，此外还有一些分子遗传标记物如Ras、p53抑癌基因、C-erb2和Bc1-2以及一些分子分化蛋白标记物如Ki-67等，其中一些标记物对于监视肿瘤的发生，化疗敏感性和手术预后判断都具有一定意义。同时发现肿瘤患者血清中检测到大量针对肿瘤特异性或相关性抗原的自身抗体，如针对p53突变基因、Mucin、Her-2/neu等的抗体。但是这些，这些标记物对肿瘤检测的特异性和灵敏度目前仍不能满足临床需要，这些肿瘤抗原自身抗体在临床上的真正意义有待于进一步深入研究，包括这些抗体的产生和肿瘤的病理分类和病理阶段、肿瘤的早期诊断和预后、肿瘤的转移、患者的术后生存率和死亡率、以及其与目前常用于检测肿瘤的标记物之间的关系等等诸多问题，至今仍未获得满意的结果。 1995年，Sahin首次报道应用重组cDNA表达文库血清分析法（serological analysis of recombinant cDNA expression libraries， SEREX）筛选肿瘤抗原基因编码蛋白，即以肿瘤患者自体血清中高滴度的抗体为探针，从cDNA表达文库中筛选得到阳性克隆，通过组织表达谱的分析，明确表达蛋白的免疫生物学特征。最近，协作单位（上海市免疫学研究所）应用SEREX法筛选了自行构建的人卵巢癌cDNA表达文库，获得多个cDNA阳性克隆，经组织表达谱初步测定和序列分析，发现一个新基因位于人染色体9q34.3，长度345bp，编码114个氨基酸，蛋白分子量12KD左右，等电点为8.93，利用生物学信息网络预测发现该蛋白含有线粒体定向序列，并经绿色荧光融合蛋白转入COS-7细胞中，在共聚焦显微镜下发现细胞核外分布许多荧光点，位置和线粒体位置相似，并通过线粒体特异性探针加以证实。根据这一蛋白初步的免疫学特性和亚细胞定位，将其命名为肿瘤抗原-线粒体蛋白12（TAMP12）。Northern blot和免疫组化法分析在某些肿瘤细胞株和组织中，TAM12 mRNA和蛋白均高表达，因而提示发现TAM12是一种广泛的具有免疫原性的肿瘤特异性抗原，初步实验结果表明肿瘤患者外周血中TAM12自身抗体的检出率大大高于正常人群组，显示TAM12可以有效激发机体的免疫应答。同时提示TAM12及其自身抗体可能作为新的肿瘤标记物，其在肿瘤的临床诊断、预后判断中具有潜在的应用价值。 我们分别用免疫组化法和ELISA法检测了正常人和肿瘤患者组织、血清和细胞中TAMP12抗原（或抗体）的表达情况，免疫组化结果显示TAMP12抗原在肝癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌和肾癌等肿瘤组织中高表达，而且癌症恶性程度越高，侵袭性越强，TAMP12抗原表达越高。以TAMP12抗原包被的ELISA板检测48例正常人血清及113例各种肿瘤患者血清中TAMP12抗体水平，结果经统计后发现，正常人组OD均值为0.17±0.07，肿瘤病人组OD均值为0.32±0.15，两组有显著的统计学意义（p<0.0001），以大于正常人组OD值＋2SD作为界值，113例肿瘤患者中有46例为阳性。以上结果提示TAMP12是一种潜在的肿瘤相关抗原，为进一步深入研究TAMP12蛋白及其抗体应用于临床肿瘤的辅助诊断奠定可靠基础。 (5)成果的创造性、先进性：寻找新的肿瘤特异性或相关型标志物是肿瘤临床诊断、治疗和术后跟踪的重要辅助手段。本项目以基础研究结合临床应用，收集了多种临床肿瘤标本，初步建立了测定TAMP12抗原和特异性抗体的实验方法，并在正常人和肿瘤患者中显示存在显著差异，表明TAMP12抗原（或抗体）与肿瘤存在相关性，这为发展肿瘤特异性诊断试剂盒奠定了基础。 (6)作用意义（直接经济效益和社会意义）：拟在该基因克隆、原核表达以及肿瘤表达谱分析等上述工作基础上，建立TAM12蛋白免疫组织化学分析法和TAM12抗体的ELISA检测试剂盒，通过收集大量临床上正常、良性和肿瘤患者血清，探讨TAM12抗原和血清抗体的定量检测与其他肿瘤标记物的关系，以及与肿瘤病理类型和恶性程度的相互关系，为肿瘤的临床诊断和防治提供新的标记物和有效手段。继续申请资助深入研究，从事试剂盒试制，质量控制考核，扩大样品检测，逐步过渡于临床的常规肿瘤辅助诊断应用。预期可能产生一定的经济和社会效益。 (7)存在的问题和改进意见：存在的问题：1.本研究采用试验方法为免疫组织化学方法，该方法是基于蛋白水平的检测，并且对某些操作环节的技术要求较高，如切片的制作，开始制作的切片无法达到实验的要求，后多次改进；在实验环节上也存在不足，如标本的保存，要求及时留取标本，尽可能的保留标本的理化特性，但由于实际工作的困难，留取标本置入超低温环境间隔时间较长，导致标本理化特性下降，所以为了保证实验的严谨性，早期一批标本只好舍弃，这无疑延长了实验周期。2.由于课题时间相对短，同时二级医院部分病例数相对较少的原因，研究样本量相对较小，结果可能出现统计学偏差。 改进意见：1.扩大样本数量，减少统计学偏差。2.严把各个环节质量，减少误差，缩短实验时间。