SARS（严重急性呼吸综合症）是2002年底首发于中国广东省的一种非典型性肺炎，其病原是一种新型冠状病毒。SARS疫情的爆发严重威胁世界人民的身体健康和生命安全，危害社会生活和经济发展。以往动物冠状病毒疫苗研究结果表明，灭活疫苗是防治动物冠状病毒病的最有效方法之一。本研究针对灭活疫苗的优点和可行性，在广州市科技局经费资助下，对SARS灭活疫苗进行开发，并进行了相关研究。取得的主要成果如下： （1）分离鉴定了两个广东代表毒株SARS-CoV F69和Z2-Y3，并作为疫苗用毒株获得了SFDA的认可，建立了SARS病毒的大规模培养体系，对灭活的SARS－CoV F69病毒株培养液先后用分子质量为500 000和100 000的滤膜进行超滤，收集相对分子质量介于100 000～500 000之间的组分，并浓缩，超滤后活性抗原蛋白质回收率7.6%，纯化倍数为9，抗原活性达到1：480。并确定了灭活方法（56℃、60min或0.4%甲醛）。在小鼠、大鼠、兔、猪、马、猴等多种动物模型上评价其免疫效果，根据佐剂不同，将BALB/C、C57BL/6J小鼠及SD大鼠分为3个实验组：弗氏佐剂组、氢氧化铝佐剂组以及CpG佐剂组；同时，设立阴性对照。各组皆间隔2周免疫3次。采血分离血清，进行微量中和抗体试验和ELISA。结果表明，接种了SARS灭活疫苗的实验动物IgG及中和抗体效价均远高于阴性对照组，且其消长规律与SARS患者血清中特异性IgG抗体的变化规律是一致的。表明SARS灭活疫苗具有较强的免疫原性，可有效刺激机体产生特异性抗体，诱导中和抗体反应。而且灭活疫苗加佐剂免疫动物后，可刺激动物机体的CD4+T细胞亚群比例升高。SARS灭活疫苗在主动免疫方面有着重大的意义，为疫苗的应用奠定了基础。 （2）本研究在国内外首次用制备的灭活疫苗免疫马，制备出一定量的特异性抗SARS免疫球蛋白，中和抗体效价达到1：14240，并采用胃蛋白酶消化－切向流超滤－阴离子交换层析进行纯化，1L抗血清可获得～15gF(ab|)2片段，纯度达到90%以上，并具有交叉保护作用。制备的免疫球蛋白可用于高危人群的紧急预防和治疗，作为紧急药物储备，具有重要现实意义。该研究为抗体的制备及纯化建立了工作平台，已申请发明专利，专利号：[200310112372.5]，论文在《Acta Pharmacologica Sinica》上发表。同时，国家食品药品监督管理局根据本研究技术及实验方法制定了《马抗SARS病毒免疫球蛋白研制技术要求》，加强了各地抗SARS免疫球蛋白研发工作的管理，对预防和应对SARS的爆发具有指导意义。 （3）以灭活的SARS冠状病毒免疫健康猪，取免疫后猪的脾脏和淋巴结，透析法提取转移因子，理化检测结果表明，制备的特异性转移因子为淡黄色澄清液体。PH为6.68，核糖含量为75Pg/ml，多肤含量为1.1mg/ml，260与280nm波长处的吸收度比值为2.036。无菌、热原、异常毒性、过敏试验、蛋白质反应等检验结果均为阴性。巨噬细胞吞噬功能试验证明能促进巨噬细胞吞噬功能。白细胞黏附抑制试验显示该品能提高未黏附白细胞抑制指数。SARS冠状病毒特异转移因子具有免疫增强作用和特异的免疫活性，为SARS的预防和治疗提供了新的思路。本技术已申请发明专利，专利号为：[200310112374.4]。 （4）以灭活的SARS冠状病毒免疫健康猪，取免疫猪的肝脏，碱性缓冲液－冷酚法提取特异性免疫核糖核酸，并进行精制、纯化和分装。本研究所制备的抗SARS-CoV特异性免疫核糖核酸，为抗SARS-CoV免疫药物研制提供了基础，已申请发明专利，专利号为：[200310112375.9]。 （5）通过使用印制有SARS-CoV蛋白和糖类抗原的芯片对马抗SARS-CoV血清(包括中和抗体)指纹扫描。结果发现，SARS-CoV中和抗体具有独特的非必需的自身抗体反应能力。这种自身免疫反应性是由一种在人血清中含量丰富的糖蛋白的碳水化合物复合物（ASOR）引起的，说明SARS-CoV是一种新的病毒，可能提示在感染过程中能够引起自身免疫性疾病，这一发现对病人的临床治疗具有指导意义。这一发现引起世界同行专家的高度关注，为SARS的免疫致病机理研究奠定基础。该项研究在美国著名杂志《Physiological Genomics》上发表，并正式收录生理基因组学期刊中。并在本期内容配发编辑部评论，美国《The Scientists》对该研究和多糖芯片技术做了重点介绍。 （6）非结构蛋白是SARS病毒的多聚酶蛋白，在病毒复制过程中起重要作用，为研究其在流行过程中的变异规律，用RT-PCR扩增SARS－CoVF69株的nsp2、nsp3、nsp5的基因序列，分别构建至真核表达载体pCI-neo，转染细胞进行表达鉴定。将nsp2、nsp3、nsp5的基因序列与Genbank数据库中的SARS－CoV序列进行比对，发现nsp2、nsp3、nsp5基因在流行过程中有基因变异，但相对稳定，为寻找抗SARS病毒药物靶标奠定基础。本研究还用生物信息学软件预测了nsp2、nsp3、nsp5三种非结构蛋白的二级和三级结构，初步预测了蛋白功能，为进一步探索SARS病毒的结构和功能奠定了基础。 （7）该项目的开展培养了5名硕士和2名博士。本项目还培养1名本科生参加全国大学生挑战杯，获得全国“二等奖”。 （8）本项目已在国内核心期刊发表19篇文章，在国内外期刊发表SCI论文11篇。申请发明专利8项。

SARS（严重急性呼吸综合症）是2002年底首发于中国广东省的一种非典型性肺炎，其病原是一种新型冠状病毒。SARS疫情的爆发严重威胁世界人民的身体健康和生命安全，危害社会生活和经济发展。以往动物冠状病毒疫苗研究结果表明，灭活疫苗是防治动物冠状病毒病的最有效方法之一。本研究针对灭活疫苗的优点和可行性，在广州市科技局经费资助下，对SARS灭活疫苗进行开发，并进行了相关研究。取得的主要成果如下： （1）分离鉴定了两个广东代表毒株SARS-CoV F69和Z2-Y3，并作为疫苗用毒株获得了SFDA的认可，建立了SARS病毒的大规模培养体系，对灭活的SARS－CoV F69病毒株培养液先后用分子质量为500 000和100 000的滤膜进行超滤，收集相对分子质量介于100 000～500 000之间的组分，并浓缩，超滤后活性抗原蛋白质回收率7.6%，纯化倍数为9，抗原活性达到1：480。并确定了灭活方法（56℃、60min或0.4%甲醛）。在小鼠、大鼠、兔、猪、马、猴等多种动物模型上评价其免疫效果，根据佐剂不同，将BALB/C、C57BL/6J小鼠及SD大鼠分为3个实验组：弗氏佐剂组、氢氧化铝佐剂组以及CpG佐剂组；同时，设立阴性对照。各组皆间隔2周免疫3次。采血分离血清，进行微量中和抗体试验和ELISA。结果表明，接种了SARS灭活疫苗的实验动物IgG及中和抗体效价均远高于阴性对照组，且其消长规律与SARS患者血清中特异性IgG抗体的变化规律是一致的。表明SARS灭活疫苗具有较强的免疫原性，可有效刺激机体产生特异性抗体，诱导中和抗体反应。而且灭活疫苗加佐剂免疫动物后，可刺激动物机体的CD4+T细胞亚群比例升高。SARS灭活疫苗在主动免疫方面有着重大的意义，为疫苗的应用奠定了基础。 （2）本研究在国内外首次用制备的灭活疫苗免疫马，制备出一定量的特异性抗SARS免疫球蛋白，中和抗体效价达到1：14240，并采用胃蛋白酶消化－切向流超滤－阴离子交换层析进行纯化，1L抗血清可获得～15gF(ab|)2片段，纯度达到90%以上，并具有交叉保护作用。制备的免疫球蛋白可用于高危人群的紧急预防和治疗，作为紧急药物储备，具有重要现实意义。该研究为抗体的制备及纯化建立了工作平台，已申请发明专利，专利号：[200310112372.5]，论文在《Acta Pharmacologica Sinica》上发表。同时，国家食品药品监督管理局根据本研究技术及实验方法制定了《马抗SARS病毒免疫球蛋白研制技术要求》，加强了各地抗SARS免疫球蛋白研发工作的管理，对预防和应对SARS的爆发具有指导意义。 （3）以灭活的SARS冠状病毒免疫健康猪，取免疫后猪的脾脏和淋巴结，透析法提取转移因子，理化检测结果表明，制备的特异性转移因子为淡黄色澄清液体。PH为6.68，核糖含量为75Pg/ml，多肤含量为1.1mg/ml，260与280nm波长处的吸收度比值为2.036。无菌、热原、异常毒性、过敏试验、蛋白质反应等检验结果均为阴性。巨噬细胞吞噬功能试验证明能促进巨噬细胞吞噬功能。白细胞黏附抑制试验显示该品能提高未黏附白细胞抑制指数。SARS冠状病毒特异转移因子具有免疫增强作用和特异的免疫活性，为SARS的预防和治疗提供了新的思路。本技术已申请发明专利，专利号为：[200310112374.4]。 （4）以灭活的SARS冠状病毒免疫健康猪，取免疫猪的肝脏，碱性缓冲液－冷酚法提取特异性免疫核糖核酸，并进行精制、纯化和分装。本研究所制备的抗SARS-CoV特异性免疫核糖核酸，为抗SARS-CoV免疫药物研制提供了基础，已申请发明专利，专利号为：[200310112375.9]。 （5）通过使用印制有SARS-CoV蛋白和糖类抗原的芯片对马抗SARS-CoV血清(包括中和抗体)指纹扫描。结果发现，SARS-CoV中和抗体具有独特的非必需的自身抗体反应能力。这种自身免疫反应性是由一种在人血清中含量丰富的糖蛋白的碳水化合物复合物（ASOR）引起的，说明SARS-CoV是一种新的病毒，可能提示在感染过程中能够引起自身免疫性疾病，这一发现对病人的临床治疗具有指导意义。这一发现引起世界同行专家的高度关注，为SARS的免疫致病机理研究奠定基础。该项研究在美国著名杂志《Physiological Genomics》上发表，并正式收录生理基因组学期刊中。并在本期内容配发编辑部评论，美国《The Scientists》对该研究和多糖芯片技术做了重点介绍。 （6）非结构蛋白是SARS病毒的多聚酶蛋白，在病毒复制过程中起重要作用，为研究其在流行过程中的变异规律，用RT-PCR扩增SARS－CoVF69株的nsp2、nsp3、nsp5的基因序列，分别构建至真核表达载体pCI-neo，转染细胞进行表达鉴定。将nsp2、nsp3、nsp5的基因序列与Genbank数据库中的SARS－CoV序列进行比对，发现nsp2、nsp3、nsp5基因在流行过程中有基因变异，但相对稳定，为寻找抗SARS病毒药物靶标奠定基础。本研究还用生物信息学软件预测了nsp2、nsp3、nsp5三种非结构蛋白的二级和三级结构，初步预测了蛋白功能，为进一步探索SARS病毒的结构和功能奠定了基础。 （7）该项目的开展培养了5名硕士和2名博士。本项目还培养1名本科生参加全国大学生挑战杯，获得全国“二等奖”。 （8）本项目已在国内核心期刊发表19篇文章，在国内外期刊发表SCI论文11篇。申请发明专利8项。