一、任务来源 本课题源自国家自然科学基金项目，编号30271428；教育部“优秀青年教师资助计划”项目，教人司[2002]40号；高等学校博士学科点专项科研基金资助项目，编号B1200058。 二、应用领域 口腔应用基础医学研究领域、骨代谢医学研究领域、细胞力学研究领域。 三、技术原理 1. 破骨细胞的体外培养及纯化 采用机械分离法和诱导培养法体外培养破骨细胞，以胰酶消化法纯化，获得了大量高纯度的破骨细胞；分析了实验动物年龄对诱导破骨细胞效果的影响；成功分离和提取了人滞留乳牙根吸收面的破骨细胞；确定了可靠的破骨细胞培养、纯化方法及观察的有利时段，为研究生理状态下的破骨细胞探索了新的途径。 2. 流体剪切力实验系统的设计及制作 设计制作了一套可量化应力的细胞流体力学实验系统，最大限度降低了静水压的影响，液体流动无脉动现象，流槽内无气泡形成及培养基渗漏，细胞加力后可继续培养而无污染。该系统可用于研究破骨细胞等细胞在形态学、生理生化等方面对流体剪切力的反应，已获专利（专利号：200420034438）。 3. 破骨细胞的形态学分析 应用动态观察、图像分析、激光扫描共聚焦显微镜、倒置相差显微镜等手段，分析流体剪切力作用下破骨细胞的形态及超微结构变化。发现随着流体剪切力作用时间及强度的增加，破骨细胞形态呈波动性变化，细胞内容物不断运动，透光性降低，直径、面积、胞内空泡面积、移动距离均有增大趋势；细胞骨架中的F-actin环破坏，不能维持皱褶缘，从而影响骨吸收活性。推测形变的产生是由于细胞骨架发生改变的结果，并且与细胞内基因的表达变化有关联。 4. 破骨细胞信号转导机制的研究 应用酶组织化学、RT-PCR、巢氏PCR等手段，对破骨细胞重要的信号因子及功能性酶进行了一系列研究。对破骨细胞空泡型质子泵mRNA表达的时间效应进行检测，选择了最佳检测时段；对流体剪切力作用下破骨细胞TRAP酶、ODF/RANKL mRNA、降钙素受体(CTR) mRNA、整合素аVβ3 mRNA、碳酸酐酶Ⅱ（Ca II ）mRNA、组织蛋白酶k（Cat K ）mRNA、空泡型质子泵mRNA表达的情况进行检测；将流体剪切力应用于 cAMP抑制剂、MAPK抑制剂与骨髓源破骨细胞共培养体系，分析信号通路受体阻断剂与流体剪切力协同作用对破骨细胞成熟、分化的影响；对破骨细胞内游离Ca离子的空间分布进行观察；并研究人乳牙牙根吸收面破骨细胞碱性磷酸酶的表达情况。发现在稳定流体剪切力作用下，破骨细胞的增殖、分化、TRAP 酶代谢受到抑制，抑制作用与cAMP-PKA信号通路有关；降钙素受体、空泡型质子泵mRNA的表达上调，RANKL因子、整合素、Ca II、Cat K mRNA的表达下调，调节水平均与流体剪切力的大小和作用时间相关，提示流体剪切力不仅抑制破骨细胞的形成，还通过改变其胞内关键信号因子的转录水平而影响骨吸收； Ca离子浓度在胞内不同位置及细胞器不同，提示破骨细胞可能通过Ca离子浓度的空间差异来调节自身调节功能；人乳牙牙根吸收面的破骨细胞有碱性磷酸酶的表达，提示多核破骨细胞具有使血液中的破骨细胞的前体细胞聚集到吸收区的作用。 四、与国内外同类技术比较 口腔医学领域中，许多生理过程和病理变化与应力应变关系密切。颌骨组织在各种复杂的咬合力、正畸力的作用下进行着改建，改建过程受全身和局部的多种因子调控，其中多数细胞现象与流体剪切力相关，研究流体剪切力作用下骨细胞的生物学行为及其调控的信号转导机制，可能是解决相关问题的关键。目前的研究中，有关应力对成骨细胞影响的较多，破骨细胞的则相对较少。 Theill、Rubin、Burger等的研究提示，应力作用下破骨细胞骨吸收活性与其形态、内部结构的改变和信号因子的调节两方面因素有关。但是，在国外研究中，涉及破骨细胞在流体剪切力作用下的形态学改变的甚少，尤其缺乏动态观察及胞内超微结构改变的资料；流体剪切力对破骨细胞的重要信号因子影响尚不清楚，相关的信号转导通路也无定论，缺乏流体剪切力作用下破骨细胞空泡性质子泵、TRAP酶、ODF/RANKL、降钙素受体、整合素аVβ3、Ca Ⅱ、Cat K、以及信号通路受体阻断剂方面的研究。在国内研究中，除本课题组外，尚未见到有关流体剪切力作用下的破骨细胞形态、信号转导方面的研究。此外，由于破骨细胞作为终末分化细胞，体外培养困难，目前尚不能传代，其分离纯化仍是相关研究的热点及难点；传统的流体剪切力类细胞培养加力装置为平行平板流室，尚存在着难以实时监测、细胞易污染、培养基存在渗漏等一系列不利于实验顺利进行的问题。 本项目建立、验证并确定了可靠的破骨细胞体外培养、纯化方法，并对人滞留乳牙破骨细胞进行了成功的分离与提取，为研究生理状态下的破骨细胞探索了新的途径。设计制作了一套能用于破骨细胞的性能良好的流体剪切力加载装置，克服了传统平行平板流室存在的一系列问题，降低了静水压的影响，流槽密闭无污染，细胞加力后可继续培养。在此基础上，对流体剪切力作用下破骨细胞形态、超微结构、及其信号转导的变化进行系统研究，首次确定了破骨细胞ATP6Vla1、TcIRG1 mRNA表达的时间效应规律，以及动物年龄对破骨细胞培养效果的影响。发现流体剪切力作用下破骨细胞形态呈波动性变化，F-actin环破坏、空泡面积和移动性增加，其改变可能与细胞内分子表达有关联；破骨细胞增殖和分化受到抑制，抑制作用与cAMP-PKA信号通路有关；降钙素受体、空泡型质子泵mRNA表达上调，RANKL、整合素、Ca Ⅱ、Cat K mRNA表达下调，流体剪切力通过改变其胞内关键信号因子的转录水平而影响骨吸收。 本课题是我国迄今开展较早，较为系统的破骨细胞流体力学研究工作，工作上有创新，技术上有发展，对于推动骨代谢研究有积极的作用和较高的实用价值，项目在整体上达到国际先进水平。 五、成果的创造性、先进性 1. 建立了准确可靠的流体剪切力——细胞体外培养实验系统，具有应力量化、加力持续培养、实时动态观察和密闭性能好等优点，可用于破骨细胞等多种细胞的力学研究。 2. 验证了破骨细胞的体外培养及纯化方法，首次分析了实验动物年龄对破骨细胞培养效果的影响，发现年龄越小，细胞活性越强，诱导破骨细胞也越多。 3. 对人滞留乳牙牙根吸收面破骨细胞进行了成功的提取与分离，为研究生理状态下的破骨细胞探索了新的途径，并首次揭示多核破骨细胞具有使血液中的破骨细胞的前体细胞聚集到吸收区的作用。 4. 动态观察到流体剪切力作用下细胞形态的波动性变化，发现 F-actin环破坏、空泡面积和移动性增加，推测可能与细胞内分子表达有关联。 5. 首次检测并确定了破骨细胞空泡型质子泵mRNA表达的时间效应，提示破骨细胞分子表达存在时间规律性，在其分子学检测中要注意选择最佳时间段。 6. 首次对破骨细胞重要信号因子及功能性酶（Trap酶、ODF/RANKL、降钙素受体、整合素аVβ3、Ca II、Cat K、空泡型质子泵）进行检测，揭示在稳定流体剪切力作用下，破骨细胞增殖、分化、及相关酶代谢受到抑制；并提出流体剪切力不仅抑制破骨细胞的形成，还通过改变其胞内关键信号因子的转录水平而影响骨吸收。 7. 首次将流体剪切力应用于信号通路受体阻断剂与破骨细胞共培养体系，发现上述抑制作用与cAMP-PKA信号通路有关。 六、作用意义 本研究成功提取了人滞留乳牙牙根吸收面的破骨细胞，为破骨细胞体外培养探索了新的途径。建立的细胞流体剪切力实验系统性能优良、成本较低，具有明显创新性，为破骨细胞力学开展深入研究创造了条件，具有极大的实用价值。其研究结论有力地促进了应力状态下的骨改建机理研究，为了解破骨细胞的机械力学反应特征和相应力学信号的调控机制提供了实验依据，推动了破骨细胞生物学功能的生物力学机制研究的进展，对破骨细胞骨吸收性疾病的防治具有重要意义和实用价值，有广阔的应用前景。其研究成果大大丰富了应力作用下骨代谢机理的教学及科研内容，对相关科研项目的研究起了积极的带动及指导作用，提高了牙槽骨吸收、种植体周骨破坏等疾病的防治水平，促进了相关学科的发展，产生了显著的社会效益和经济效益。 七、应用情况 本项目系对破骨细胞在流体剪切力作用下形态学及其信号转导机制的系列研究，其研究结果为人们认识流体剪切力在破骨细胞及骨组织代谢中的作用提供了重要的科学依据，其新观点和新方法为相关骨代谢疾病的防治开辟了新思路，具有良好的社会效益和应用前景。本研究在“Cell Biology International”等国内外杂志发表论文12篇，其中新近发表2篇，SCI收录1篇，medline收录5篇。多次参加国际、国内学术会议。培养博士研究生9名，相关博士研究生学位论文6篇。项目组研制的流体剪切力--细胞体外培养实验系统准确可靠，已获专利。研究成果为进一步阐明骨重建机制奠定了理论基础，其观点和方法不仅得到同行的认可，而且已纳入研究生和继续教育的教学和科研之中，大大丰富了破骨细胞骨吸收的教学内容，对相关科研项目起到了重要的带动参考作用，推进了我国相关骨代谢疾病防治的研究进程。本成果在第四军医大学口腔医学院、首都医科大学附属北京口腔医院、南京医科大学附属口腔医院、重庆医科大学口腔学医院、武汉大学口腔医学院、浙江大学医学院、山东大学口腔医学院、昆明医学院附属口腔医院、贵阳医学院、西南交通大学材料学院四川省人工器官表面工程试验室等十几所国内知名院校的教学及科研中得到推广和普及，促进了人才的培养，对提高牙槽骨吸收、种植体周骨破坏、及其它骨代谢疾病的防治水平起到了积极作用。

一、任务来源 本课题源自国家自然科学基金项目，编号30271428；教育部“优秀青年教师资助计划”项目，教人司[2002]40号；高等学校博士学科点专项科研基金资助项目，编号B1200058。 二、应用领域 口腔应用基础医学研究领域、骨代谢医学研究领域、细胞力学研究领域。 三、技术原理 1. 破骨细胞的体外培养及纯化 采用机械分离法和诱导培养法体外培养破骨细胞，以胰酶消化法纯化，获得了大量高纯度的破骨细胞；分析了实验动物年龄对诱导破骨细胞效果的影响；成功分离和提取了人滞留乳牙根吸收面的破骨细胞；确定了可靠的破骨细胞培养、纯化方法及观察的有利时段，为研究生理状态下的破骨细胞探索了新的途径。 2. 流体剪切力实验系统的设计及制作 设计制作了一套可量化应力的细胞流体力学实验系统，最大限度降低了静水压的影响，液体流动无脉动现象，流槽内无气泡形成及培养基渗漏，细胞加力后可继续培养而无污染。该系统可用于研究破骨细胞等细胞在形态学、生理生化等方面对流体剪切力的反应，已获专利（专利号：200420034438）。 3. 破骨细胞的形态学分析 应用动态观察、图像分析、激光扫描共聚焦显微镜、倒置相差显微镜等手段，分析流体剪切力作用下破骨细胞的形态及超微结构变化。发现随着流体剪切力作用时间及强度的增加，破骨细胞形态呈波动性变化，细胞内容物不断运动，透光性降低，直径、面积、胞内空泡面积、移动距离均有增大趋势；细胞骨架中的F-actin环破坏，不能维持皱褶缘，从而影响骨吸收活性。推测形变的产生是由于细胞骨架发生改变的结果，并且与细胞内基因的表达变化有关联。 4. 破骨细胞信号转导机制的研究 应用酶组织化学、RT-PCR、巢氏PCR等手段，对破骨细胞重要的信号因子及功能性酶进行了一系列研究。对破骨细胞空泡型质子泵mRNA表达的时间效应进行检测，选择了最佳检测时段；对流体剪切力作用下破骨细胞TRAP酶、ODF/RANKL mRNA、降钙素受体(CTR) mRNA、整合素аVβ3 mRNA、碳酸酐酶Ⅱ（Ca II ）mRNA、组织蛋白酶k（Cat K ）mRNA、空泡型质子泵mRNA表达的情况进行检测；将流体剪切力应用于 cAMP抑制剂、MAPK抑制剂与骨髓源破骨细胞共培养体系，分析信号通路受体阻断剂与流体剪切力协同作用对破骨细胞成熟、分化的影响；对破骨细胞内游离Ca离子的空间分布进行观察；并研究人乳牙牙根吸收面破骨细胞碱性磷酸酶的表达情况。发现在稳定流体剪切力作用下，破骨细胞的增殖、分化、TRAP 酶代谢受到抑制，抑制作用与cAMP-PKA信号通路有关；降钙素受体、空泡型质子泵mRNA的表达上调，RANKL因子、整合素、Ca II、Cat K mRNA的表达下调，调节水平均与流体剪切力的大小和作用时间相关，提示流体剪切力不仅抑制破骨细胞的形成，还通过改变其胞内关键信号因子的转录水平而影响骨吸收； Ca离子浓度在胞内不同位置及细胞器不同，提示破骨细胞可能通过Ca离子浓度的空间差异来调节自身调节功能；人乳牙牙根吸收面的破骨细胞有碱性磷酸酶的表达，提示多核破骨细胞具有使血液中的破骨细胞的前体细胞聚集到吸收区的作用。 四、与国内外同类技术比较 口腔医学领域中，许多生理过程和病理变化与应力应变关系密切。颌骨组织在各种复杂的咬合力、正畸力的作用下进行着改建，改建过程受全身和局部的多种因子调控，其中多数细胞现象与流体剪切力相关，研究流体剪切力作用下骨细胞的生物学行为及其调控的信号转导机制，可能是解决相关问题的关键。目前的研究中，有关应力对成骨细胞影响的较多，破骨细胞的则相对较少。 Theill、Rubin、Burger等的研究提示，应力作用下破骨细胞骨吸收活性与其形态、内部结构的改变和信号因子的调节两方面因素有关。但是，在国外研究中，涉及破骨细胞在流体剪切力作用下的形态学改变的甚少，尤其缺乏动态观察及胞内超微结构改变的资料；流体剪切力对破骨细胞的重要信号因子影响尚不清楚，相关的信号转导通路也无定论，缺乏流体剪切力作用下破骨细胞空泡性质子泵、TRAP酶、ODF/RANKL、降钙素受体、整合素аVβ3、Ca Ⅱ、Cat K、以及信号通路受体阻断剂方面的研究。在国内研究中，除本课题组外，尚未见到有关流体剪切力作用下的破骨细胞形态、信号转导方面的研究。此外，由于破骨细胞作为终末分化细胞，体外培养困难，目前尚不能传代，其分离纯化仍是相关研究的热点及难点；传统的流体剪切力类细胞培养加力装置为平行平板流室，尚存在着难以实时监测、细胞易污染、培养基存在渗漏等一系列不利于实验顺利进行的问题。 本项目建立、验证并确定了可靠的破骨细胞体外培养、纯化方法，并对人滞留乳牙破骨细胞进行了成功的分离与提取，为研究生理状态下的破骨细胞探索了新的途径。设计制作了一套能用于破骨细胞的性能良好的流体剪切力加载装置，克服了传统平行平板流室存在的一系列问题，降低了静水压的影响，流槽密闭无污染，细胞加力后可继续培养。在此基础上，对流体剪切力作用下破骨细胞形态、超微结构、及其信号转导的变化进行系统研究，首次确定了破骨细胞ATP6Vla1、TcIRG1 mRNA表达的时间效应规律，以及动物年龄对破骨细胞培养效果的影响。发现流体剪切力作用下破骨细胞形态呈波动性变化，F-actin环破坏、空泡面积和移动性增加，其改变可能与细胞内分子表达有关联；破骨细胞增殖和分化受到抑制，抑制作用与cAMP-PKA信号通路有关；降钙素受体、空泡型质子泵mRNA表达上调，RANKL、整合素、Ca Ⅱ、Cat K mRNA表达下调，流体剪切力通过改变其胞内关键信号因子的转录水平而影响骨吸收。 本课题是我国迄今开展较早，较为系统的破骨细胞流体力学研究工作，工作上有创新，技术上有发展，对于推动骨代谢研究有积极的作用和较高的实用价值，项目在整体上达到国际先进水平。 五、成果的创造性、先进性 1. 建立了准确可靠的流体剪切力——细胞体外培养实验系统，具有应力量化、加力持续培养、实时动态观察和密闭性能好等优点，可用于破骨细胞等多种细胞的力学研究。 2. 验证了破骨细胞的体外培养及纯化方法，首次分析了实验动物年龄对破骨细胞培养效果的影响，发现年龄越小，细胞活性越强，诱导破骨细胞也越多。 3. 对人滞留乳牙牙根吸收面破骨细胞进行了成功的提取与分离，为研究生理状态下的破骨细胞探索了新的途径，并首次揭示多核破骨细胞具有使血液中的破骨细胞的前体细胞聚集到吸收区的作用。 4. 动态观察到流体剪切力作用下细胞形态的波动性变化，发现 F-actin环破坏、空泡面积和移动性增加，推测可能与细胞内分子表达有关联。 5. 首次检测并确定了破骨细胞空泡型质子泵mRNA表达的时间效应，提示破骨细胞分子表达存在时间规律性，在其分子学检测中要注意选择最佳时间段。 6. 首次对破骨细胞重要信号因子及功能性酶（Trap酶、ODF/RANKL、降钙素受体、整合素аVβ3、Ca II、Cat K、空泡型质子泵）进行检测，揭示在稳定流体剪切力作用下，破骨细胞增殖、分化、及相关酶代谢受到抑制；并提出流体剪切力不仅抑制破骨细胞的形成，还通过改变其胞内关键信号因子的转录水平而影响骨吸收。 7. 首次将流体剪切力应用于信号通路受体阻断剂与破骨细胞共培养体系，发现上述抑制作用与cAMP-PKA信号通路有关。 六、作用意义 本研究成功提取了人滞留乳牙牙根吸收面的破骨细胞，为破骨细胞体外培养探索了新的途径。建立的细胞流体剪切力实验系统性能优良、成本较低，具有明显创新性，为破骨细胞力学开展深入研究创造了条件，具有极大的实用价值。其研究结论有力地促进了应力状态下的骨改建机理研究，为了解破骨细胞的机械力学反应特征和相应力学信号的调控机制提供了实验依据，推动了破骨细胞生物学功能的生物力学机制研究的进展，对破骨细胞骨吸收性疾病的防治具有重要意义和实用价值，有广阔的应用前景。其研究成果大大丰富了应力作用下骨代谢机理的教学及科研内容，对相关科研项目的研究起了积极的带动及指导作用，提高了牙槽骨吸收、种植体周骨破坏等疾病的防治水平，促进了相关学科的发展，产生了显著的社会效益和经济效益。 七、应用情况 本项目系对破骨细胞在流体剪切力作用下形态学及其信号转导机制的系列研究，其研究结果为人们认识流体剪切力在破骨细胞及骨组织代谢中的作用提供了重要的科学依据，其新观点和新方法为相关骨代谢疾病的防治开辟了新思路，具有良好的社会效益和应用前景。本研究在“Cell Biology International”等国内外杂志发表论文12篇，其中新近发表2篇，SCI收录1篇，medline收录5篇。多次参加国际、国内学术会议。培养博士研究生9名，相关博士研究生学位论文6篇。项目组研制的流体剪切力--细胞体外培养实验系统准确可靠，已获专利。研究成果为进一步阐明骨重建机制奠定了理论基础，其观点和方法不仅得到同行的认可，而且已纳入研究生和继续教育的教学和科研之中，大大丰富了破骨细胞骨吸收的教学内容，对相关科研项目起到了重要的带动参考作用，推进了我国相关骨代谢疾病防治的研究进程。本成果在第四军医大学口腔医学院、首都医科大学附属北京口腔医院、南京医科大学附属口腔医院、重庆医科大学口腔学医院、武汉大学口腔医学院、浙江大学医学院、山东大学口腔医学院、昆明医学院附属口腔医院、贵阳医学院、西南交通大学材料学院四川省人工器官表面工程试验室等十几所国内知名院校的教学及科研中得到推广和普及，促进了人才的培养，对提高牙槽骨吸收、种植体周骨破坏、及其它骨代谢疾病的防治水平起到了积极作用。