艰难梭菌(Clostridium difficile)是伪膜性肠炎和抗生素相关性腹泻的主要病因。目前为止，国内尚没有实验室诊断试剂，对此类疾病的诊断主要是细胞培养、细菌分离及使用结肠镜直接观察，这样就使得对一些病情轻微、或早期感染病人不宜发现，而且局部缺血性肠炎、痢疾、阿米巴痢疾等其他疾病可混淆诊断，此外，这些诊断方法不仅费时，而且需要特殊实验条件。因此，对此疾病的快速诊断不仅非常重要，而且也有助于指导对该疾病的临床治疗和医院内感染的控制。 　　本实验采用标准艰难梭菌菌株进行产毒培养，利用盐析、酸沉淀、层析纯化艰难梭菌A毒素，免疫小鼠制备单克隆抗体，目的在于为制备艰难梭菌A毒素的简便快速的诊断方法打下基础，弥补国内在这一领域的临床需要。 　　具体内容及技术指标如下： 　　(1)艰难梭菌A毒素的纯化 　　a.毒素制备及纯化（透析培养、盐析、酸沉淀、柱层析） 　　b.活性检测： 　　小鼠毒性试验 　　细胞毒性试验 　　血管通透性试验 　　凝血活性测定 　　c.分子量测定（PAGE） 　　(2)艰难梭菌A毒素单克隆抗体（Mab）制备 　　a.免疫BALB/C小鼠 　　b.细胞融合（BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞） 　　c.融合细胞的筛选（ELISA） 　　d.腹水制备及单克隆抗体（Mab）纯化 　　e.单克隆抗体的鉴定及分型 　　艰难梭菌(Clostridium difficile)是伪膜性肠炎和抗生素相关性腹泻的主要病因，也是医院内感染的主要病原菌之一。目前为止，国内尚没有实验室诊断试剂，对此类疾病的诊断主要是细胞培养、细菌分离及使用结肠镜直接观察，这样就使得对一些病情轻微、或早期感染病人不宜发现，而且局部缺血性肠炎、痢疾、阿米巴痢疾等其他疾病可混淆诊断，此外，这些诊断方法不仅费时，而且需要特殊实验条件。因此，对此疾病的快速诊断不仅非常重要，而且也有助于指导对该疾病的临床治疗和医院内感染的控制。 　　本实验采用标准艰难梭菌菌株进行产毒培养，纯化艰难梭菌A毒素，免疫小鼠制备单克隆抗体并利用其制备酶标试剂盒，首先，建立了一种改进的纯化艰难梭菌A毒素的方法。该纯化方法操作简便、实用、可在制药及医药实验室推广使用，适合大规模制备A毒素。为艰难梭菌A毒素在基础和临床的应用方面提供了制备方法。 　　其次，成功制备了抗艰难梭菌A毒素的单克隆抗体。单克隆抗体的获得无论在艰难梭菌的预防及临床实验室诊断方面都有重要的意义。在后续的诊断试剂盒研制中已证明其良好的稳定性、特异性和灵敏度。

　　艰难梭菌(Clostridium difficile)是伪膜性肠炎和抗生素相关性腹泻的主要病因。目前为止，国内尚没有实验室诊断试剂，对此类疾病的诊断主要是细胞培养、细菌分离及使用结肠镜直接观察，这样就使得对一些病情轻微、或早期感染病人不宜发现，而且局部缺血性肠炎、痢疾、阿米巴痢疾等其他疾病可混淆诊断，此外，这些诊断方法不仅费时，而且需要特殊实验条件。因此，对此疾病的快速诊断不仅非常重要，而且也有助于指导对该疾病的临床治疗和医院内感染的控制。 　　本实验采用标准艰难梭菌菌株进行产毒培养，利用盐析、酸沉淀、层析纯化艰难梭菌A毒素，免疫小鼠制备单克隆抗体，目的在于为制备艰难梭菌A毒素的简便快速的诊断方法打下基础，弥补国内在这一领域的临床需要。 　　具体内容及技术指标如下： 　　(1)艰难梭菌A毒素的纯化 　　a.毒素制备及纯化（透析培养、盐析、酸沉淀、柱层析） 　　b.活性检测： 　　小鼠毒性试验 　　细胞毒性试验 　　血管通透性试验 　　凝血活性测定 　　c.分子量测定（PAGE） 　　(2)艰难梭菌A毒素单克隆抗体（Mab）制备 　　a.免疫BALB/C小鼠 　　b.细胞融合（BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞） 　　c.融合细胞的筛选（ELISA） 　　d.腹水制备及单克隆抗体（Mab）纯化 　　e.单克隆抗体的鉴定及分型 　　艰难梭菌(Clostridium difficile)是伪膜性肠炎和抗生素相关性腹泻的主要病因，也是医院内感染的主要病原菌之一。目前为止，国内尚没有实验室诊断试剂，对此类疾病的诊断主要是细胞培养、细菌分离及使用结肠镜直接观察，这样就使得对一些病情轻微、或早期感染病人不宜发现，而且局部缺血性肠炎、痢疾、阿米巴痢疾等其他疾病可混淆诊断，此外，这些诊断方法不仅费时，而且需要特殊实验条件。因此，对此疾病的快速诊断不仅非常重要，而且也有助于指导对该疾病的临床治疗和医院内感染的控制。 　　本实验采用标准艰难梭菌菌株进行产毒培养，纯化艰难梭菌A毒素，免疫小鼠制备单克隆抗体并利用其制备酶标试剂盒，首先，建立了一种改进的纯化艰难梭菌A毒素的方法。该纯化方法操作简便、实用、可在制药及医药实验室推广使用，适合大规模制备A毒素。为艰难梭菌A毒素在基础和临床的应用方面提供了制备方法。 　　其次，成功制备了抗艰难梭菌A毒素的单克隆抗体。单克隆抗体的获得无论在艰难梭菌的预防及临床实验室诊断方面都有重要的意义。在后续的诊断试剂盒研制中已证明其良好的稳定性、特异性和灵敏度。