肾脏组织病理学对肾脏疾病的诊断、治疗及判定预后具有决定性作用，而常规取材后的肾组织长时间处于缺血状态，采用常规固定方法易产生组织、细胞结构的改变和成分的移位，不能客观真实地反映其病理学的变化。 本研究采用全新的活体内冷冻技术(in vivo cryotechnique)，结合冷冻置换方法(freeze-substitution)对小鼠的肾组织进行处理，原位(in situ)保持了组织、细胞的结构及成分，最大限度地展示了活体内细胞及组织的机能状况，捕获了组织、细胞生理和病理状态下的瞬间变化。客观真实地反映了不同血液动力学条件下，血清可溶性蛋白（白蛋白、免疫球蛋白G及其亚群等）和肾小球滤过膜足细胞标志蛋白ZO-1在肾小球内的分布，探讨了异常血液动力学情况下相关蛋白质的移动机制。目前国内外尚未见相关报道。 血液动力学因素，例如血压和血流，在影响活体小鼠肾脏结构和功能等方面发挥重要作用。在实验及病理等异常血液动力学条件下，肾小球毛细血管袢可产生血清蛋白的漏出而形成蛋白尿，影响肾脏疾病的进程。高滤过血清蛋白经由Bowman囊进入近端肾小管，加重了肾小管的再吸收。无论动物实验还是临床研究都证实了大量血清蛋白的漏出对肾脏近端小管上皮十分有害，经常会导致肾间质的炎症和纤维化。这种现象提示血清蛋白的漏出是加速肾脏组织病理恶化，最终导致慢性肾脏疾病的重要因素。另一方面，由于传统组织化学标本制做技术的限制（例如浸泡或者灌流固定），目前还不能直接客观真实而形象化地反映正常或异常血液动力学条件下，肾小球滤过膜对血清蛋白选择性滤过以及转移性近端肾小管的重吸收情况。常规缓冲液中的固定成分，如戊二醛和多聚甲醛由于具有交联特性，对动物的细胞和组织具有良好的固定作用。然而，在常规灌流和浸泡固定过程中，为了最终达到交联可溶性物质的固定目的，需要相当长的时间来完成，而且许多被固定的组织成分被冲走或发生移位，产生人工假象。因此，原位(in situ)保留活体动物中细胞和组织成分对测定其活体内功能结构是非常必要的。 因为形态学研究的最终目标应该是客观真实地反映被测定细胞和组织所有的生理或病理特征，所以本研究开展的活体内冷冻技术(in vivo cryotechnique)，选用异戊烷—丙烷混合冷冻剂(-193℃)预冷的手术刀取材，即达到了捕获瞬间动态活体小鼠肾脏超微结构的目的。采用此项技术活体小鼠肾脏内的所有生物进程被即刻停止，随后进行冷冻置换。由于组织中的水分几乎同时冻结，形成无数个极小的冰晶，同时冰晶停止生长，达到无定形微晶态或玻璃态。此时由于冰晶很小（约20nm^3）不会对细胞和组织造成很大的损伤，所以能够原位保持其所有的结构与成分。通常的冷冻置换技术是在低温条件下，在含有固定液的无水有机溶液中快速冷冻的细胞和组织内某些物质成分被交联，限制可溶性分子的弥散。由于细腻、极小的冰晶形成在冷冻的细胞和组织中，所以保留了某些暴露的抗原位点。最后，经过冰冻固定和冷冻置换的标本被用于光镜、共聚焦显微镜以及免疫电镜检查，或者冰冻固定以后直接进行冷冻复膜(replica)等观察。 众所周知，肾小球滤过屏障是由有孔的内皮细胞、肾小球基底膜、上皮足突细胞以及足突间的裂孔隔膜组成。作为阻止大分子通过的最后屏障，足突之间的40nm左右的裂孔，由极薄的裂孔隙膜相连，构成一种拉链式结构，略小于白蛋白，故能有效地阻止血浆蛋白及部分有用物质的丢失。足细胞表面覆盖着一层唾液酸糖蛋白与肾小球基底膜一样带有负电荷，是参与维持肾小球滤过膜电荷屏障的物质基础。它们组成的分子与电荷选择性屏障在防止血清蛋白漏出方面发挥着重要的作用。通过电镜观察在正常血液循环情况下，大鼠血清白蛋白主要分布在基底膜滤过屏障的致密层和外层，免疫球蛋白G在基底膜的各层都有分布。在由血管紧张素Ⅱ诱发的急性高血压动物模型中，血清白蛋白和免疫球蛋白G在基底膜与尿腔中的分布明显增多，而且在肾小球系膜基质也有少量分布。然而，上述实验的取材方法是原位采用4%多聚甲醛点滴固定。此方法在固定过程中容易引起活体大鼠肾小球毛细血管袢血液动力学的紊乱，以及诱发血清蛋白通过毛细血管袢的漏出，而产生血清蛋白的易位，故不能准确反映活体内肾小球真实客观的形态与功能结构。既往关于肾小球基底膜与蛋白尿关系的研究较多，新近利用蛋白示踪技术研究显示，足突裂孔隔膜对限制血浆蛋白通过尤为关键。然而，关于裂孔隔膜的分子组成直到最近几年才有所了解，如zonula occludens-1(ZO-1)、Podocin、CD2相关蛋白(CD2AP)、Nephrin等，它们对维持裂孔隔膜正常的形态结构与屏障功能十分重要，若发生异常可导致大量蛋白尿。 目前由于标本处理的技术限制，尚未见关于采用薄石蜡切片，应用光镜及共聚焦激光扫描显微镜对肾小球滤过膜选择性或非选择性滤过血清可溶性蛋白以及肾小球滤过膜固有的结构蛋白进行客观真实、直接形象化的研究报道。在本项研究中，我们应用活体内冷冻技术，通过建立小鼠各种血液动力学动物模型（正常血液循环、停止血液供给、缺血及急性高血压），客观真实地反映了不同血液动力学条件下血清可溶性蛋白（例如：白蛋白，免疫球蛋白G及其重链、轻链等）在肾小球内的移动机制与具体沉积位点以及肾小球滤过膜足细胞间特殊的细胞连接结构——裂孔隔膜的标志蛋白ZO-1的分布变化，并利用间接免疫荧光和三重免疫荧光染色技术，应用共聚焦激光扫描显微镜等技术对它们直接免疫定位使其形象化。探讨异常血液动力学情况下血清可溶性蛋白移动途径与机制。进一步探讨肾小球滤过膜足细胞标志蛋白ZO-1的分布规律与肾小球损伤之间的相关性。为阐明肾小球发病机理和提高肾小球疾病的病理诊断提供了新线索、开辟了新思路。 推广应用情况及应用前景 本项目先后在国外、国内国家级核心期刊发表相关论著14篇，其中SCI收录共8篇（第一作者3篇、BA收录1篇、CSCD收录2篇，另外1篇SCI收录的文章在印刷中）。多次参加国际、国内学术会议并大会交流20次（国际学术会议3次、日本学术会议15次、全国肾脏病会议2次）。研究成果和实验方法在国内数家教学单位应用，已取得一定的经济效益和社会效益。本项目的研究成果处于国际领先地位，在此研究的基础上，今后应进一步完善实验方法，尽快促使成果应用于临床，以产生更好的经济效益和社会效益。

肾脏组织病理学对肾脏疾病的诊断、治疗及判定预后具有决定性作用，而常规取材后的肾组织长时间处于缺血状态，采用常规固定方法易产生组织、细胞结构的改变和成分的移位，不能客观真实地反映其病理学的变化。 本研究采用全新的活体内冷冻技术(in vivo cryotechnique)，结合冷冻置换方法(freeze-substitution)对小鼠的肾组织进行处理，原位(in situ)保持了组织、细胞的结构及成分，最大限度地展示了活体内细胞及组织的机能状况，捕获了组织、细胞生理和病理状态下的瞬间变化。客观真实地反映了不同血液动力学条件下，血清可溶性蛋白（白蛋白、免疫球蛋白G及其亚群等）和肾小球滤过膜足细胞标志蛋白ZO-1在肾小球内的分布，探讨了异常血液动力学情况下相关蛋白质的移动机制。目前国内外尚未见相关报道。 血液动力学因素，例如血压和血流，在影响活体小鼠肾脏结构和功能等方面发挥重要作用。在实验及病理等异常血液动力学条件下，肾小球毛细血管袢可产生血清蛋白的漏出而形成蛋白尿，影响肾脏疾病的进程。高滤过血清蛋白经由Bowman囊进入近端肾小管，加重了肾小管的再吸收。无论动物实验还是临床研究都证实了大量血清蛋白的漏出对肾脏近端小管上皮十分有害，经常会导致肾间质的炎症和纤维化。这种现象提示血清蛋白的漏出是加速肾脏组织病理恶化，最终导致慢性肾脏疾病的重要因素。另一方面，由于传统组织化学标本制做技术的限制（例如浸泡或者灌流固定），目前还不能直接客观真实而形象化地反映正常或异常血液动力学条件下，肾小球滤过膜对血清蛋白选择性滤过以及转移性近端肾小管的重吸收情况。常规缓冲液中的固定成分，如戊二醛和多聚甲醛由于具有交联特性，对动物的细胞和组织具有良好的固定作用。然而，在常规灌流和浸泡固定过程中，为了最终达到交联可溶性物质的固定目的，需要相当长的时间来完成，而且许多被固定的组织成分被冲走或发生移位，产生人工假象。因此，原位(in situ)保留活体动物中细胞和组织成分对测定其活体内功能结构是非常必要的。 因为形态学研究的最终目标应该是客观真实地反映被测定细胞和组织所有的生理或病理特征，所以本研究开展的活体内冷冻技术(in vivo cryotechnique)，选用异戊烷—丙烷混合冷冻剂(-193℃)预冷的手术刀取材，即达到了捕获瞬间动态活体小鼠肾脏超微结构的目的。采用此项技术活体小鼠肾脏内的所有生物进程被即刻停止，随后进行冷冻置换。由于组织中的水分几乎同时冻结，形成无数个极小的冰晶，同时冰晶停止生长，达到无定形微晶态或玻璃态。此时由于冰晶很小（约20nm^3）不会对细胞和组织造成很大的损伤，所以能够原位保持其所有的结构与成分。通常的冷冻置换技术是在低温条件下，在含有固定液的无水有机溶液中快速冷冻的细胞和组织内某些物质成分被交联，限制可溶性分子的弥散。由于细腻、极小的冰晶形成在冷冻的细胞和组织中，所以保留了某些暴露的抗原位点。最后，经过冰冻固定和冷冻置换的标本被用于光镜、共聚焦显微镜以及免疫电镜检查，或者冰冻固定以后直接进行冷冻复膜(replica)等观察。 众所周知，肾小球滤过屏障是由有孔的内皮细胞、肾小球基底膜、上皮足突细胞以及足突间的裂孔隔膜组成。作为阻止大分子通过的最后屏障，足突之间的40nm左右的裂孔，由极薄的裂孔隙膜相连，构成一种拉链式结构，略小于白蛋白，故能有效地阻止血浆蛋白及部分有用物质的丢失。足细胞表面覆盖着一层唾液酸糖蛋白与肾小球基底膜一样带有负电荷，是参与维持肾小球滤过膜电荷屏障的物质基础。它们组成的分子与电荷选择性屏障在防止血清蛋白漏出方面发挥着重要的作用。通过电镜观察在正常血液循环情况下，大鼠血清白蛋白主要分布在基底膜滤过屏障的致密层和外层，免疫球蛋白G在基底膜的各层都有分布。在由血管紧张素Ⅱ诱发的急性高血压动物模型中，血清白蛋白和免疫球蛋白G在基底膜与尿腔中的分布明显增多，而且在肾小球系膜基质也有少量分布。然而，上述实验的取材方法是原位采用4%多聚甲醛点滴固定。此方法在固定过程中容易引起活体大鼠肾小球毛细血管袢血液动力学的紊乱，以及诱发血清蛋白通过毛细血管袢的漏出，而产生血清蛋白的易位，故不能准确反映活体内肾小球真实客观的形态与功能结构。既往关于肾小球基底膜与蛋白尿关系的研究较多，新近利用蛋白示踪技术研究显示，足突裂孔隔膜对限制血浆蛋白通过尤为关键。然而，关于裂孔隔膜的分子组成直到最近几年才有所了解，如zonula occludens-1(ZO-1)、Podocin、CD2相关蛋白(CD2AP)、Nephrin等，它们对维持裂孔隔膜正常的形态结构与屏障功能十分重要，若发生异常可导致大量蛋白尿。 目前由于标本处理的技术限制，尚未见关于采用薄石蜡切片，应用光镜及共聚焦激光扫描显微镜对肾小球滤过膜选择性或非选择性滤过血清可溶性蛋白以及肾小球滤过膜固有的结构蛋白进行客观真实、直接形象化的研究报道。在本项研究中，我们应用活体内冷冻技术，通过建立小鼠各种血液动力学动物模型（正常血液循环、停止血液供给、缺血及急性高血压），客观真实地反映了不同血液动力学条件下血清可溶性蛋白（例如：白蛋白，免疫球蛋白G及其重链、轻链等）在肾小球内的移动机制与具体沉积位点以及肾小球滤过膜足细胞间特殊的细胞连接结构——裂孔隔膜的标志蛋白ZO-1的分布变化，并利用间接免疫荧光和三重免疫荧光染色技术，应用共聚焦激光扫描显微镜等技术对它们直接免疫定位使其形象化。探讨异常血液动力学情况下血清可溶性蛋白移动途径与机制。进一步探讨肾小球滤过膜足细胞标志蛋白ZO-1的分布规律与肾小球损伤之间的相关性。为阐明肾小球发病机理和提高肾小球疾病的病理诊断提供了新线索、开辟了新思路。 推广应用情况及应用前景 本项目先后在国外、国内国家级核心期刊发表相关论著14篇，其中SCI收录共8篇（第一作者3篇、BA收录1篇、CSCD收录2篇，另外1篇SCI收录的文章在印刷中）。多次参加国际、国内学术会议并大会交流20次（国际学术会议3次、日本学术会议15次、全国肾脏病会议2次）。研究成果和实验方法在国内数家教学单位应用，已取得一定的经济效益和社会效益。本项目的研究成果处于国际领先地位，在此研究的基础上，今后应进一步完善实验方法，尽快促使成果应用于临床，以产生更好的经济效益和社会效益。