本研究： 1、探索了新的软骨细胞来源棗人胚软骨细胞和骨髓间充质干细胞（MSC）的增殖分化规律；探索与人胚软骨细胞和MSC增殖分化相关的某些细胞因子及激素类的调节作用； 2、在这些发育生物学规律的研究基础上，为该两种新来源的软骨细胞和软骨祖细胞的软骨组织工程的开发提供理论基础。 研究结果： 1. 发现人胚软骨细胞在高低密度两种微环境下所培养的软骨细胞的表型和新陈代谢规律有明显差异。 分离的人胚软骨细胞按4万/孔的高密度培养时，细胞在6～12小时开始贴壁，24小时开始分裂增殖，3～5天时在培养板已形成细胞单层，表现出很强的贴壁和增殖能力。此时细胞形状呈扁平或多角形。在新陈代谢上，应用35S-示踪掺入分析证明，细胞中有大量的软骨特异的蛋白多糖分子，并向细胞外分泌。说明这些软骨细胞表现出高度分化特点。与此相比，按1万/孔的较低密度培养的人胚软骨细胞随着培养时间的进程，其原有的软骨分化表型逐渐丧失，未见有软骨蛋白多糖合成。 这些结果表明，软骨细胞分化表型明显依赖于培养软骨细胞的初始密度和培养的微环境。 2. MSC（Meserchymal Stem Cell）具有软骨祖细胞分化潜能 MSC是来源于骨髓的间充质干细胞，在发育生物学上它具有转化为各种间胚叶组织细胞的能力，所以被称为间胚叶组织干细胞。MSC同时具有分化成骨及软骨祖细胞等多种间胚叶细胞的潜力。在体外培养时，这些细胞能进一步分化成为软骨细胞和骨细胞。过去在骨损伤修复方面曾被临床应用，而在软骨损伤修复的研究尚且少见。本文关于MSC的发育生物学研究证明，它对于软骨组织损伤的修复应用具有很大的潜在价值。 3. 软骨组织工程学的三个必需因素： 从细胞、细胞调节因子和细胞外基质的原则出发，本文选用天然细胞外基质的胶原、几丁质作为MSC和人胚软骨细胞的基质网架，为细胞提供一个增殖、分化的三维空间，将移植细胞固定于网架中，构成人工软骨移植物。经体内的细胞移植实验证明，这些移植物在适当的微环境下，具有明显的软骨增殖、分化能力。在动物体内MSC移植物还表现出软骨生成性（Chondrogenesis）的诱导现象。 4. 研究了多种细胞因子和激素对于软骨细胞及MSC的增殖、分化调节作用 具体研究PdCGF、TGF-β、胰岛素等多种因子对于人胚软骨细胞的增殖分化调节作用，以及应用FGF、HGF、胰岛素、地塞米松、氢化可的松等多种调节因子对MSC的增殖分化调节作用。已知这些因子如bFGF、PdCGF等具有明显的软骨细胞增殖促进作用，TGF-β等能促进蛋白多糖合成，cdCGF（ChM-1）则有抑制局部血管新生作用。这些结果为选择各种调节因子的优势互补条件、开发和改进人工软骨移植物的软骨组织工程程序奠定了理论依据。 在人胚关节软骨细胞和MSC的体外增殖、分化规律的研究基础上，结合目前生物技术与生物材料学的发展，本文将人胚软骨细胞与MSC应用于动物体关节软骨缺损的修复研究，取得了以下研究进展： 1. 人胚软骨细胞移植物在移植后第二周，肉眼可见关节缺损灶被白色组织填充；在第四周时缺损灶的填充完整，关节表面平滑，有些标本的修复组织与周边正常软骨组织已开始整合。组织形态学所见，于术后四周时缺损移植灶可见大量移植细胞，有透明软骨形成；术后八周时，缺损移植灶的软骨细胞呈柱状排列，变为透明软骨修复。 由于该移植性质属于异种异体性细胞移植，人胚软骨细胞移植灶在移植早期曾出现炎性细胞浸润；但随着术后时间的延长，炎性细胞浸润逐渐减轻，在第八周时已不再有炎性浸润。 2. MSC移植物在动物体内的软骨生成和缺损修复作用 MSC移植物植入家兔关节缺损处二周即可见MSC向软骨细胞分化的迹象；在第四周家兔关节软骨缺失移植处的组织切片，可见大多数MSC转化成软骨细胞。经用甲苯胺蓝染色，细胞被强烈的异染色基质所包围。这些结果说明植入的MSC不仅在形态学上转化为软骨细胞，且在细胞内产生出大量的蛋白多糖，并向细胞周围分泌。 与此同时，未移植MSC移植物的对照组，完全未见上述变化。这些结果有力地证明在本文实验条件下，软骨缺损灶内的MSC确实发生了向软骨细胞分化诱导现象，显示出MSC的软骨祖细胞的特性。 在上述变化过程中，动物关节软骨缺损处的移植灶逐渐被新生的软骨组织所代替，修复软骨的表面平滑，其与邻近的正常软骨的整合较好，软骨细胞由缺损表面向深层方向排列成柱状，并逐渐肥大化，呈典型的透明软骨修复，软骨下骨已完成重建。 以上这些结果表明，本文所应用的两种新细胞来源，即人胚软骨细胞移植和MSC移植的动物实验都取得了预期的良好结果。 3. 人胚软骨细胞库及MSC库的建立 本文关于人胚软骨细胞和MSC的发育生物学研究表明，它们在关节软骨移植中占有以下优点： 1)细胞的取材比较方便。从细胞来源和满足受体的需要量方面，由于细胞培养技术的发展，以MSC为例只要经过6代传代培养，可能扩增5000倍。因此，只要少量原材料培养扩增即可满足要求，其中人胚软骨细胞可以在不损害受体病人的条件下完成。 2)如前所述，人胚软骨细胞具有初期分化细胞特征，因此，它的免疫原性较低，并且在移植组织局部很快逐步消失。推测人胚软骨细胞在同种异体关节软骨移植应用中，其免疫反应将达到可以忽略的程度。Chu等（1999）关于人类异体关节软骨移植的55例长期疗效观察中，也提示同种异体的人类关节软骨移植效果很少受免疫反应影响。在长达7～10年的追踪观察中，治疗的显效和良好率达70%以上。这些结果为临床病人的同种异软骨移植的有效性提供了范例。 3)我们设想，本文关节软骨细胞移植的动物实验和Chu等的人体关节异体移植结果，分别从实验室和临床角度，为应用人胚软骨细胞进行软骨缺损修复提示了可行性前景。 综上所述，本题在我室过去关于软骨组织工程研究基础上，又取得了以下一些新进展： 1.建立了人胚关节软骨细胞的体外培养模型，并研究了人胚关节软骨细胞的增殖、分化特点。 2.研究了PdCGF对培养的人胚软骨细胞增殖的影响。认为它是与血小板中已知的细胞因子所不同的、新的软骨细胞增殖、分化调节因子。 3.建立了分离、纯化、扩增MSC的技术，并且研究FGF、HGF、胰岛素、氢化可的松、地塞米松等多种生长因子及细胞因子对MSC的不同调节作用。 4.将人胚关节软骨细胞与MSC应用于动物关节软骨缺损的修复，两种人工软骨移植物都取得了比较满意的结果，其关节修复明显地优于对照组，为关节软骨损伤修复提供了新途径。 5.初步建立了人胚关节软骨细胞库，骨髓中的MSC库，并能稳定地进行传代、冻存及复苏。 　　应用前景：目前在国内，尚无利用人工软骨组织移植修复关节软骨损伤的先例。因此，应用本课题组已经成熟的组织工程技术，在相关细胞因子的调节下，由培养、扩增的人胚胎软骨细胞或骨髓间充质干细胞，体外构建具有任意形状和特定功能的软骨组织块（产品），可供临床上不同类型软骨损害病人（创伤性或关节炎性软骨缺损）使用组织工程人工软骨。

本研究： 1、探索了新的软骨细胞来源棗人胚软骨细胞和骨髓间充质干细胞（MSC）的增殖分化规律；探索与人胚软骨细胞和MSC增殖分化相关的某些细胞因子及激素类的调节作用； 2、在这些发育生物学规律的研究基础上，为该两种新来源的软骨细胞和软骨祖细胞的软骨组织工程的开发提供理论基础。 研究结果： 1. 发现人胚软骨细胞在高低密度两种微环境下所培养的软骨细胞的表型和新陈代谢规律有明显差异。 分离的人胚软骨细胞按4万/孔的高密度培养时，细胞在6～12小时开始贴壁，24小时开始分裂增殖，3～5天时在培养板已形成细胞单层，表现出很强的贴壁和增殖能力。此时细胞形状呈扁平或多角形。在新陈代谢上，应用35S-示踪掺入分析证明，细胞中有大量的软骨特异的蛋白多糖分子，并向细胞外分泌。说明这些软骨细胞表现出高度分化特点。与此相比，按1万/孔的较低密度培养的人胚软骨细胞随着培养时间的进程，其原有的软骨分化表型逐渐丧失，未见有软骨蛋白多糖合成。 这些结果表明，软骨细胞分化表型明显依赖于培养软骨细胞的初始密度和培养的微环境。 2. MSC（Meserchymal Stem Cell）具有软骨祖细胞分化潜能 MSC是来源于骨髓的间充质干细胞，在发育生物学上它具有转化为各种间胚叶组织细胞的能力，所以被称为间胚叶组织干细胞。MSC同时具有分化成骨及软骨祖细胞等多种间胚叶细胞的潜力。在体外培养时，这些细胞能进一步分化成为软骨细胞和骨细胞。过去在骨损伤修复方面曾被临床应用，而在软骨损伤修复的研究尚且少见。本文关于MSC的发育生物学研究证明，它对于软骨组织损伤的修复应用具有很大的潜在价值。 3. 软骨组织工程学的三个必需因素： 从细胞、细胞调节因子和细胞外基质的原则出发，本文选用天然细胞外基质的胶原、几丁质作为MSC和人胚软骨细胞的基质网架，为细胞提供一个增殖、分化的三维空间，将移植细胞固定于网架中，构成人工软骨移植物。经体内的细胞移植实验证明，这些移植物在适当的微环境下，具有明显的软骨增殖、分化能力。在动物体内MSC移植物还表现出软骨生成性（Chondrogenesis）的诱导现象。 4. 研究了多种细胞因子和激素对于软骨细胞及MSC的增殖、分化调节作用 具体研究PdCGF、TGF-β、胰岛素等多种因子对于人胚软骨细胞的增殖分化调节作用，以及应用FGF、HGF、胰岛素、地塞米松、氢化可的松等多种调节因子对MSC的增殖分化调节作用。已知这些因子如bFGF、PdCGF等具有明显的软骨细胞增殖促进作用，TGF-β等能促进蛋白多糖合成，cdCGF（ChM-1）则有抑制局部血管新生作用。这些结果为选择各种调节因子的优势互补条件、开发和改进人工软骨移植物的软骨组织工程程序奠定了理论依据。 在人胚关节软骨细胞和MSC的体外增殖、分化规律的研究基础上，结合目前生物技术与生物材料学的发展，本文将人胚软骨细胞与MSC应用于动物体关节软骨缺损的修复研究，取得了以下研究进展： 1. 人胚软骨细胞移植物在移植后第二周，肉眼可见关节缺损灶被白色组织填充；在第四周时缺损灶的填充完整，关节表面平滑，有些标本的修复组织与周边正常软骨组织已开始整合。组织形态学所见，于术后四周时缺损移植灶可见大量移植细胞，有透明软骨形成；术后八周时，缺损移植灶的软骨细胞呈柱状排列，变为透明软骨修复。 由于该移植性质属于异种异体性细胞移植，人胚软骨细胞移植灶在移植早期曾出现炎性细胞浸润；但随着术后时间的延长，炎性细胞浸润逐渐减轻，在第八周时已不再有炎性浸润。 2. MSC移植物在动物体内的软骨生成和缺损修复作用 MSC移植物植入家兔关节缺损处二周即可见MSC向软骨细胞分化的迹象；在第四周家兔关节软骨缺失移植处的组织切片，可见大多数MSC转化成软骨细胞。经用甲苯胺蓝染色，细胞被强烈的异染色基质所包围。这些结果说明植入的MSC不仅在形态学上转化为软骨细胞，且在细胞内产生出大量的蛋白多糖，并向细胞周围分泌。 与此同时，未移植MSC移植物的对照组，完全未见上述变化。这些结果有力地证明在本文实验条件下，软骨缺损灶内的MSC确实发生了向软骨细胞分化诱导现象，显示出MSC的软骨祖细胞的特性。 在上述变化过程中，动物关节软骨缺损处的移植灶逐渐被新生的软骨组织所代替，修复软骨的表面平滑，其与邻近的正常软骨的整合较好，软骨细胞由缺损表面向深层方向排列成柱状，并逐渐肥大化，呈典型的透明软骨修复，软骨下骨已完成重建。 以上这些结果表明，本文所应用的两种新细胞来源，即人胚软骨细胞移植和MSC移植的动物实验都取得了预期的良好结果。 3. 人胚软骨细胞库及MSC库的建立 本文关于人胚软骨细胞和MSC的发育生物学研究表明，它们在关节软骨移植中占有以下优点： 1)细胞的取材比较方便。从细胞来源和满足受体的需要量方面，由于细胞培养技术的发展，以MSC为例只要经过6代传代培养，可能扩增5000倍。因此，只要少量原材料培养扩增即可满足要求，其中人胚软骨细胞可以在不损害受体病人的条件下完成。 2)如前所述，人胚软骨细胞具有初期分化细胞特征，因此，它的免疫原性较低，并且在移植组织局部很快逐步消失。推测人胚软骨细胞在同种异体关节软骨移植应用中，其免疫反应将达到可以忽略的程度。Chu等（1999）关于人类异体关节软骨移植的55例长期疗效观察中，也提示同种异体的人类关节软骨移植效果很少受免疫反应影响。在长达7～10年的追踪观察中，治疗的显效和良好率达70%以上。这些结果为临床病人的同种异软骨移植的有效性提供了范例。 3)我们设想，本文关节软骨细胞移植的动物实验和Chu等的人体关节异体移植结果，分别从实验室和临床角度，为应用人胚软骨细胞进行软骨缺损修复提示了可行性前景。 综上所述，本题在我室过去关于软骨组织工程研究基础上，又取得了以下一些新进展： 1.建立了人胚关节软骨细胞的体外培养模型，并研究了人胚关节软骨细胞的增殖、分化特点。 2.研究了PdCGF对培养的人胚软骨细胞增殖的影响。认为它是与血小板中已知的细胞因子所不同的、新的软骨细胞增殖、分化调节因子。 3.建立了分离、纯化、扩增MSC的技术，并且研究FGF、HGF、胰岛素、氢化可的松、地塞米松等多种生长因子及细胞因子对MSC的不同调节作用。 4.将人胚关节软骨细胞与MSC应用于动物关节软骨缺损的修复，两种人工软骨移植物都取得了比较满意的结果，其关节修复明显地优于对照组，为关节软骨损伤修复提供了新途径。 5.初步建立了人胚关节软骨细胞库，骨髓中的MSC库，并能稳定地进行传代、冻存及复苏。 　　应用前景：目前在国内，尚无利用人工软骨组织移植修复关节软骨损伤的先例。因此，应用本课题组已经成熟的组织工程技术，在相关细胞因子的调节下，由培养、扩增的人胚胎软骨细胞或骨髓间充质干细胞，体外构建具有任意形状和特定功能的软骨组织块（产品），可供临床上不同类型软骨损害病人（创伤性或关节炎性软骨缺损）使用组织工程人工软骨。