本课题分三个部分 　　第一部份：人脂肪干细胞体外向成骨细胞定向诱导分化的实验研究 　　1、从脂肪抽吸物中分离、培养具有多向分化潜能的脂肪干细胞，测定原代（P0）及传代（P1、P2、P5）细胞的生长曲线。 　　2、取第二代（P2）细胞为实验组，应用成骨诱导液向成骨细胞定向诱导分化，并以未诱导组为对照组，BM-Purple 染色观察碱性磷酸酶(ALP)表达，Von-Kossa染色观察钙结节，免疫荧光检测Ⅰ型胶原及骨钙蛋白（OCN），RT-PCR检测Ⅰ型胶原、骨桥蛋白（OPN）及碱性磷酸酶（ALP）mRNA表达。 　　第二部分：人脂肪干细胞与部分脱钙骨材料细胞相容性实验研究 　　1、选用P2细胞用成骨诱导液进行诱导，4d后将细胞与部分脱钙骨材料复合，培养7d后在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况；用扫描电镜对细胞材料复合物的表面和横断面进行观察。 　　2、用DIO标记细胞后采用激光共聚焦显微镜观察细胞生长情况，并测定细胞在支架材料上的粘附率；ALP定量检测试剂盒检测细胞在材料上表达ALP的情况；放射免疫的方法检测OCN表达。 　　第三部分：人脂肪干细胞与部分脱钙骨支架体内异位构建组织工程化骨的实验研究 　　1、人脂肪干细胞（hADSCs）的分离、培养。 　　2、将部分脱钙骨制成10mm×5mm×3mm大小，钴60照射灭菌，将第二代hADSCs按3×107/ml接种到部分脱钙骨材料上，将细胞-材料复合物放置于37℃、5%CO2培养箱中孵育4h，待接种细胞已粘附于材料上后，加入10%DMEM诱导培养液在体外培养7d。 　　3、裸鼠体内回植：选用5周龄的裸鼠，共16只，分为两组，每组8只，均给与乙醚吸入麻醉，于背部做横切口，长约2cm，向两侧腹部分离皮下间隙，右侧皮下植入hADSCs部分脱钙骨复合物作为实验组，左侧皮下间隙植入无细胞的部分脱钙骨，作为对照组。第一组观察期为8周，第二组观察期为12周。 　　4、取材、石蜡切片HE染色，观察成骨情况。 　　研究结果表明： 　　1、通过脂肪抽吸可以获取足量的满足骨组织工程所需要的脂肪干细胞，通过成骨诱导可以成为成骨细胞。 　　2、通过成骨诱导的人脂肪干细胞可以在部分脱钙骨上良好地粘附生长，并能表达成骨表型，人脂肪干细胞与部分脱钙骨有良好的相容性。 　　3、通过成骨诱导的人脂肪干细胞与部分脱钙骨复合物可以再裸大鼠体内形成组织工程骨。同时研究结果也表明，部分脱钙骨是一种良好的构建组织工程骨的支架材料。 　　本研究结果表明：通过脂肪抽吸可以获取足量的满足骨组织工程所需要的脂肪干细胞，通过成骨诱导可以成为成骨细胞；通过成骨诱导的人脂肪干细胞可以在部分脱钙骨上良好地粘附生长，并能表达成骨表型，人脂肪干细胞与部分脱钙骨有良好的相容性；通过成骨诱导的人脂肪干细胞与部分脱钙骨复合物可以再裸大鼠体内形成组织工程骨；同时研究结果也表明，部分脱钙骨是一种良好的构建组织工程骨的支架材料。因此，可以进行在有免疫力的大动物体内。 　　构建组织工程骨的研究，为临床应用研究奠定了基础。该研究为临床骨缺损的修复提供了一种可行的方法，另外，在临床上部分脱钙骨已经应用于骨缺损的充填材料和骨传导、骨诱导材料，具有良好的经济效益和社会效益。

　　本课题分三个部分 　　第一部份：人脂肪干细胞体外向成骨细胞定向诱导分化的实验研究 　　1、从脂肪抽吸物中分离、培养具有多向分化潜能的脂肪干细胞，测定原代（P0）及传代（P1、P2、P5）细胞的生长曲线。 　　2、取第二代（P2）细胞为实验组，应用成骨诱导液向成骨细胞定向诱导分化，并以未诱导组为对照组，BM-Purple 染色观察碱性磷酸酶(ALP)表达，Von-Kossa染色观察钙结节，免疫荧光检测Ⅰ型胶原及骨钙蛋白（OCN），RT-PCR检测Ⅰ型胶原、骨桥蛋白（OPN）及碱性磷酸酶（ALP）mRNA表达。 　　第二部分：人脂肪干细胞与部分脱钙骨材料细胞相容性实验研究 　　1、选用P2细胞用成骨诱导液进行诱导，4d后将细胞与部分脱钙骨材料复合，培养7d后在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况；用扫描电镜对细胞材料复合物的表面和横断面进行观察。 　　2、用DIO标记细胞后采用激光共聚焦显微镜观察细胞生长情况，并测定细胞在支架材料上的粘附率；ALP定量检测试剂盒检测细胞在材料上表达ALP的情况；放射免疫的方法检测OCN表达。 　　第三部分：人脂肪干细胞与部分脱钙骨支架体内异位构建组织工程化骨的实验研究 　　1、人脂肪干细胞（hADSCs）的分离、培养。 　　2、将部分脱钙骨制成10mm×5mm×3mm大小，钴60照射灭菌，将第二代hADSCs按3×107/ml接种到部分脱钙骨材料上，将细胞-材料复合物放置于37℃、5%CO2培养箱中孵育4h，待接种细胞已粘附于材料上后，加入10%DMEM诱导培养液在体外培养7d。 　　3、裸鼠体内回植：选用5周龄的裸鼠，共16只，分为两组，每组8只，均给与乙醚吸入麻醉，于背部做横切口，长约2cm，向两侧腹部分离皮下间隙，右侧皮下植入hADSCs部分脱钙骨复合物作为实验组，左侧皮下间隙植入无细胞的部分脱钙骨，作为对照组。第一组观察期为8周，第二组观察期为12周。 　　4、取材、石蜡切片HE染色，观察成骨情况。 　　研究结果表明： 　　1、通过脂肪抽吸可以获取足量的满足骨组织工程所需要的脂肪干细胞，通过成骨诱导可以成为成骨细胞。 　　2、通过成骨诱导的人脂肪干细胞可以在部分脱钙骨上良好地粘附生长，并能表达成骨表型，人脂肪干细胞与部分脱钙骨有良好的相容性。 　　3、通过成骨诱导的人脂肪干细胞与部分脱钙骨复合物可以再裸大鼠体内形成组织工程骨。同时研究结果也表明，部分脱钙骨是一种良好的构建组织工程骨的支架材料。 　　本研究结果表明：通过脂肪抽吸可以获取足量的满足骨组织工程所需要的脂肪干细胞，通过成骨诱导可以成为成骨细胞；通过成骨诱导的人脂肪干细胞可以在部分脱钙骨上良好地粘附生长，并能表达成骨表型，人脂肪干细胞与部分脱钙骨有良好的相容性；通过成骨诱导的人脂肪干细胞与部分脱钙骨复合物可以再裸大鼠体内形成组织工程骨；同时研究结果也表明，部分脱钙骨是一种良好的构建组织工程骨的支架材料。因此，可以进行在有免疫力的大动物体内。 　　构建组织工程骨的研究，为临床应用研究奠定了基础。该研究为临床骨缺损的修复提供了一种可行的方法，另外，在临床上部分脱钙骨已经应用于骨缺损的充填材料和骨传导、骨诱导材料，具有良好的经济效益和社会效益。