一．项目研究技术：
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种自身免疫性疾病，主要表现为周围对称性的多关节慢性滑膜炎症，常可导致关节软骨的破坏和骨的侵蚀，发病机制尚不完全清楚。有学者提出体内各类T淋巴细胞及其产生的细胞因子和炎症因子的失衡程度在RA滑膜炎症的发生和发展中起着重要作用。许多文献报道RA关节滑膜中出现选择性的Th1细胞活化，这表明Th1细胞因子与RA的发病机制密切相关。目前RA的传统药物治疗主要为各种病程改善类药物、糖皮质激素类药物，但许多药物多起效慢，长期使用副作用大。RA的致病因素虽不清楚，但调节细胞因子平衡及抑制炎症因子分泌也许为一种有效的治疗手段以控制慢性炎症发展。新生的生物治疗广泛应用于临床，但生物制剂昂贵、副作用大、需要反复注射并且无靶器官特异性，而基因治疗则避免了这些缺点，通过选择合适的治疗蛋白质和导入系统，选择性高，同时避免传统疗法的种种缺点，从分子水平针对发病机制进行治疗，因而较传统疗法更有优势。
已有研究证明，基因治疗在各种关节炎的动物模型中疗效明显。在本次研究中，我们构建了融合表达小鼠白细胞介素18结合蛋白（IL-18BP）和白细胞介素（IL）4基因的重组腺病毒载体（AdmIL-18BP/mIL-4），对胶原诱导型关节炎（collagen-induced arthritis,CIA）小鼠进行局部关节基因治疗，并初步探讨其作用的机制。
在本研究中，我们从小鼠脾脏中提取总RNA，逆转录成为cDNA后，用高保真聚合酶分别扩增出IL-18BP和IL-4基因序列，并用（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser）3接头连接IL-18BP与IL-4基因，并对完整的cDNA进行测序，以保证核酸序列正确性；然后利用T4 DNA连接酶连接IL-18BP与IL-4融合基因和AdEasy系统中的穿梭载体pShuttle-CMV（PSC）质粒，并转入DH5a感受态细菌，经阳性克隆筛选和PCR、酶切及测序鉴定；再将正确质粒用电转化的方法使穿梭载体转入BJ5183-AD-1感受态细菌（含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1），又经阳性克隆筛选和PCR、酶切鉴定扩增确定为融合表达小鼠IL-18BP和IL-4基因的重组腺病毒载体质粒（AdmIL-18BP/mIL-4）。同时构建对照腺病毒载体质粒AdLacZ。最后将构建的腺病毒载体质粒转入AD293细胞进行扩增，并用原代病毒上清继续感染AD293细胞，形成第二代病毒。
实验结果显示，将小鼠脾细胞RNA逆转录成cDNA后用高保真聚合酶扩增的IL-18BP和IL-4基因在1﹪琼脂糖凝胶电泳片段分别为582bp(IL-18BP)和423bp(IL-4)左右，IL-18BP/IL-4融合基因（包含接头45bp）为1050bp左右。双酶切后的IL-18BP/IL-4融合基因片段和PSC连接后形成PSC-IL-18BP/IL-4，PCR、双酶切后电泳显示有1050bp左右的片段条带，测序结果亦表明基因序列与Gene-Bank登录的一致；PSC-IL-18BP/IL-4、PSC-LacZ电转化入BJ5183-AD-1细菌后获得AdmIL-18BP/mIL-4和AdLacZ质粒，经PCR、酶切后电泳鉴定有预期大小的片段条带。将构建的腺病毒载体质粒转入AD293细胞，在细胞培养第13天，90﹪的AD293细胞出现细胞病变效应，收集细胞及培养上清再次感染AD293细胞，在细胞培养第5天几乎所有细胞均出现细胞病变效应，表明包装病毒为有活性的腺病毒。
我们将所构建的表达IL-18BP和IL-4融合基因的重组腺病毒载体（AdmIL-18BP/mIL-4），对胶原诱导型关节炎（collagen-induced arthritis,CIA）小鼠进行局部关节基因治疗，观察了CIA小鼠的关节炎指数，并采用酶联免疫吸附试验（ELISA）在不同时间段检测CIA小鼠血清TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-18及IL-1β的水平；用流式细胞仪监测不同时间段的小鼠脾细胞表达IFN-γ和IL-4的CD4+T细胞水平。采用Western印迹法检测滑膜组织细胞环氧化酶-2（COX-2）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、核因子-κB（NF-κB）p50蛋白表达水平；用竞争ELISA和硝酸酶还原法检测滑膜组织的COX-2和iNOS在关节滑膜液中的诱导产物前列腺素E2 (PGE2)和一氧化氮（NO）的含量，以探讨AdmIL-18BP/mIL-4在RA基因治疗中的作用机制。
研究发现，CIA小鼠关节腔注射AdmIL-18BP/mIL-4后，CIA小鼠关节炎指数与AdLacZ组和PBS组相比分别下降45.45﹪和40.77﹪，病情趋向稳定状态。研究其可能的作用机制发现，治疗组CIA小鼠血清IL-4、IL-10水平明显增加而IFN-γ、TNF-α和IL-1β水平明显下降，同时血清IL-18水平亦明显下降。分析表达IFN-γ或IL-4的CD4+T细胞结果显示，CIA小鼠AdmIL-18BP/mIL-4基因治疗后，表达IFN-γ的CD4+T细胞在CD4+T细胞中的百分率显著下降，并趋向正常水平，而表达IL-4的CD4+T细胞在CD4+T细胞中的百分率在AdmIL-18BP/mIL-4基因治疗后1周明显增加，4周后趋向正常水平。这些实验结果表明局部AdmIL-18BP/mIL-4基因治疗具有明显的调节CIA小鼠Th1/Th2细胞及其分泌细胞因子失衡的作用。
研究AdmIL-18BP/mIL-4基因治疗对炎症因子COX-2和iNOS及其诱导产物PGE2和NO作用的实验结果显示，局部关节AdmIL-18BP/mIL-4基因治疗后CIA小鼠滑膜组织NF-κB p50、COX-2和iNOS的蛋白表达水平均明显下降，COX-2和iNOS在关节滑膜液中的诱导产物PGE2、NO表达水平亦明显减少，这些结果表明AdmIL-18BP/mIL-4基因治疗能明显抑制小鼠滑膜组织细胞NF-κB的基因表达，使COX-2和iNOS的表达及其诱导产物PGE2和NO的合成明显下降，进而可改善关节的损伤程度及炎症病程。
RA是一种全身性疾病，机体免疫功能失调是其关节局部病理变化机制之一。我们构建了能稳定高效表达具有生物学活性的融合表达IL-18BP和IL-4基因的腺病毒载体并对CIA小鼠进行局部关节基因治疗，明显改善了Th1/Th2细胞及其分泌细胞因子以及其它炎症分子的失衡状态，使关节炎症病变得到改善。IL-18BP和IL-4联合基因治疗也许是一种较有前途的RA基因治疗方法。
二．项目研究应用前景：
1.构建了能稳定高效表达具有生物学活性的融合表达IL-18BP和IL-4基因的腺病毒载体。
2.此腺病毒载体能明显改善CIA小鼠Th1/Th2细胞及其分泌细胞因子的失衡状态，使关节炎症病变得到改善。
3.此腺病毒载体能明显抑制CIA小鼠滑膜组织COX-2和iNOS及其诱导产物PGE2和NO的表达水平，进而可改善关节的损伤程度及炎症病程，其作用机制可能是通过抑制NF-κB的基因表达。
4.本课题的研究将为RA基因治疗提供新治疗策略和理论依据。 |
