① 课题来源与背景 本课题为天津市卫生局应用研究基金课题，课题号：局06KZ41. 蛋白S（protein S PS）是由肝脏合成的维生素K依赖血浆蛋白，是活化蛋白C（Active protein C APC）发挥抗凝作用的一个重要辅因子。PS为一单链糖蛋白，分子量为65.4KD。PS也存在于血小板α颗粒以及血管内皮细胞，当血小板受刺激时释放。PS在血浆中有两种形式。60%-65%的PS以非共价键的形式与补体第一途径的调节蛋白C4b结合蛋白（C4b binding protein）结合，称为结合形PS，35%-40%左右的PS以游离形式存在。游离型与结合型在血浆中保持动态平衡，可以互相转换。PC作为天然抗凝蛋白，以酶原形式存在于血浆中，需要通过α-凝血酶以及内皮细胞表面结合的受体-血栓调节蛋白（thrombomdulin , TM）的作用，形成活化蛋白C（APC）。游离PS与APC以1:1方式形成复合物，此复合物能降低APC与磷脂表面的解离常数，导致APC与血小板或磷脂表面的亲和力增加。所以在PS存在时，APC可以更快速地灭活因子Ⅴα和Ⅷα。 PS作为抗凝因子之一，其缺乏可以造成凝血功能的异常而导致全身多部位血栓形成。遗传性PS缺陷症临床上主要以复发性静脉血栓形成为主，可累计多个部位，如腹部、肺、肾、脾等。表现为动脉血栓的也较多见，可以出现脑梗死、心肌梗死，并被认为是缺血性脑卒中的可能危险因素。其发病年龄多在30-40岁。Mutinez发现，在青年脑梗死而病因不明时，应进行PS、PC等检查；或在有家族性血栓史的年轻人中查找PS可能的基因突变，寻找隐基因性脑卒中，有利于对这类病人的预防。 ②技术原理及性能指标 通过微量PS抗原小鼠脾内包埋免疫法，采用细胞融合制备出抗PS单克隆抗体，建立血浆PS双抗体夹心ELISA测定法，为血栓性疾病的诊断提供极有价值的检测方法。血浆PS含量测定的临床结果表明急性心梗患者、肝硬化患者、DIC患者血浆PS含量较正常人明显降低（P＜0.05），遗传性PS缺陷患者血浆PS含量较正常人明显降低（P＜0.01）。 ③技术的创造性与先进性 在B细胞杂交瘤技术创立以前，人们只能用特定抗原免疫动物，而后分离、制备抗血清，这样获得的抗体为多克隆抗体。由于此多克隆抗体含有异种动物的血清成分，可导致人体产生速发型超敏反应，实际应用中仍受到很大限制。通过细胞融合技术建立的杂交瘤细胞系能合成一类或一个亚类Ig，其独特型及恒定区完全相同，为针对某单一抗原决定族的高度特异性的均质抗体，克服了抗血清特异性和亲和力变动大的缺点。从而单克隆抗体的研究及应用迅速成为生物医学领域一个活跃分支。该课题建立了微量蛋白S抗原硝酸纤维素膜脾内包埋免疫法免疫Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术以及抗体克隆化筛选，制备出抗蛋白S单克隆抗体，同时应用自制的抗蛋白S单克隆抗体与抗蛋白S多克隆抗体建立双抗体夹心ELISA方法，初步进行了临床血浆标本中的蛋白S含量的检测，该研究达到国内领先水平。 ④技术的成熟程度，适用范围和安全性 初步进行了临床血浆标本中的蛋白S含量的检测，为建立临床检测试剂盒奠定了初步的基础。 ⑤应用情况及存在的问题 该检测技术在我院及大港妇幼正在应用，今后还要与其他指标联合 应用，提高检测结果的敏感性和特异性。 ⑥历年获奖情况 蛋白C单克隆抗体的制备及其应用研究 天津市科委2003年度科技进步三等奖

① 课题来源与背景 本课题为天津市卫生局应用研究基金课题，课题号：局06KZ41. 蛋白S（protein S PS）是由肝脏合成的维生素K依赖血浆蛋白，是活化蛋白C（Active protein C APC）发挥抗凝作用的一个重要辅因子。PS为一单链糖蛋白，分子量为65.4KD。PS也存在于血小板α颗粒以及血管内皮细胞，当血小板受刺激时释放。PS在血浆中有两种形式。60%-65%的PS以非共价键的形式与补体第一途径的调节蛋白C4b结合蛋白（C4b binding protein）结合，称为结合形PS，35%-40%左右的PS以游离形式存在。游离型与结合型在血浆中保持动态平衡，可以互相转换。PC作为天然抗凝蛋白，以酶原形式存在于血浆中，需要通过α-凝血酶以及内皮细胞表面结合的受体-血栓调节蛋白（thrombomdulin , TM）的作用，形成活化蛋白C（APC）。游离PS与APC以1:1方式形成复合物，此复合物能降低APC与磷脂表面的解离常数，导致APC与血小板或磷脂表面的亲和力增加。所以在PS存在时，APC可以更快速地灭活因子Ⅴα和Ⅷα。 PS作为抗凝因子之一，其缺乏可以造成凝血功能的异常而导致全身多部位血栓形成。遗传性PS缺陷症临床上主要以复发性静脉血栓形成为主，可累计多个部位，如腹部、肺、肾、脾等。表现为动脉血栓的也较多见，可以出现脑梗死、心肌梗死，并被认为是缺血性脑卒中的可能危险因素。其发病年龄多在30-40岁。Mutinez发现，在青年脑梗死而病因不明时，应进行PS、PC等检查；或在有家族性血栓史的年轻人中查找PS可能的基因突变，寻找隐基因性脑卒中，有利于对这类病人的预防。 ②技术原理及性能指标 通过微量PS抗原小鼠脾内包埋免疫法，采用细胞融合制备出抗PS单克隆抗体，建立血浆PS双抗体夹心ELISA测定法，为血栓性疾病的诊断提供极有价值的检测方法。血浆PS含量测定的临床结果表明急性心梗患者、肝硬化患者、DIC患者血浆PS含量较正常人明显降低（P＜0.05），遗传性PS缺陷患者血浆PS含量较正常人明显降低（P＜0.01）。 ③技术的创造性与先进性 在B细胞杂交瘤技术创立以前，人们只能用特定抗原免疫动物，而后分离、制备抗血清，这样获得的抗体为多克隆抗体。由于此多克隆抗体含有异种动物的血清成分，可导致人体产生速发型超敏反应，实际应用中仍受到很大限制。通过细胞融合技术建立的杂交瘤细胞系能合成一类或一个亚类Ig，其独特型及恒定区完全相同，为针对某单一抗原决定族的高度特异性的均质抗体，克服了抗血清特异性和亲和力变动大的缺点。从而单克隆抗体的研究及应用迅速成为生物医学领域一个活跃分支。该课题建立了微量蛋白S抗原硝酸纤维素膜脾内包埋免疫法免疫Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术以及抗体克隆化筛选，制备出抗蛋白S单克隆抗体，同时应用自制的抗蛋白S单克隆抗体与抗蛋白S多克隆抗体建立双抗体夹心ELISA方法，初步进行了临床血浆标本中的蛋白S含量的检测，该研究达到国内领先水平。 ④技术的成熟程度，适用范围和安全性 初步进行了临床血浆标本中的蛋白S含量的检测，为建立临床检测试剂盒奠定了初步的基础。 ⑤应用情况及存在的问题 该检测技术在我院及大港妇幼正在应用，今后还要与其他指标联合 应用，提高检测结果的敏感性和特异性。 ⑥历年获奖情况 蛋白C单克隆抗体的制备及其应用研究 天津市科委2003年度科技进步三等奖