一、任务来源 重庆市卫生局科研项目。 项目编号：03-2-099。 项目名称：多房棘球绦虫重组BCG-EmII/3-10疫苗构建及其免疫机制研究。 二、研究背景 泡型包虫病是由于患者在狩猎过程中误食多房棘球绦虫的虫卵或孕节所致。虫卵中六钩蚴进入机体后在宿主肠内孵出，钻入小肠，经血循环至肝脏发育成泡球蚴。泡球蚴长期寄生在宿主体内，宿主针对泡球蚴将产生持久的免疫应答，因此，保护性抗原的研究方向应定位在多房棘球绦虫的幼虫—泡球蚴。 已知EmII/3-10位于泡球蚴的原头蚴生发层和育囊囊壁上，编码EmII/3-10的基因在质粒pAR3038表达水平较高，Gottstein等发现携带EmII/3-10抗原编码基因的重组伤寒沙门氏杆菌疫苗皮下注射和口服免疫C57BL/6J鼠，可引起免疫鼠脾淋巴细胞明显增殖及抗EmII/3-10特异性抗体升高，提示EmII/3-10是一种较好的保护性抗原分子，因此，本课题将EmII/3-10蛋白分子列为重点研究对象。 重组BCG疫苗是一种新型疫苗，具有许多优点：所表达的靶抗原不需纯化，可直接用于免疫注射，免去了蛋白质后处理的复杂工序；单次接种即可诱导机体产生针对靶抗原的免疫反应；运用分子生物学手段，通过对不同靶抗原的剪切和拼接，可使新型疫苗理想化；BCG本身作为一种强免疫佐剂，可提高宿主的免疫力；在人类近2×109个免疫接种者中证明BCG用于人体是安全的；它是WHO推荐使用的两种出生时即可接种的活疫苗之一；在世界范围内分布着BCG接种网，价格低廉，易于保存，适于大量生产。因此构建多房棘球绦虫重组BCG疫苗用于泡型包虫病防治可能具有十分诱人的前景，定会产生巨大的经济和社会效益。 本课题拟将多房棘球绦虫的原头蚴中的EmII/3-10抗原编码基因克隆到大肠杆菌—构建多房棘球绦虫重组BCG-EmII/3-10疫苗，研究EmII/3-10在重组BCG中的表达情况，然后将重组BCG-EmII/3-10疫苗接种BALB/c鼠，多房棘球绦虫原头蚴攻击后研究其保护性免疫机制，从而为防治多房棘球绦虫提供一种有效的疫苗。 三、研究结果 ①通过RT-PCR成功地扩增出EmⅡ/3和Em14-3-3抗原编码基因。 ②成功构建了多房棘球绦虫重组质粒pBCG-EmⅡ/3和pBCG-Em14-3-3。 ③成功构建了多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3疫苗、BCG-Em14-3-3疫苗以及混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗。 ④多房棘球绦虫重组质粒pBCG-EmⅡ/3和pBCG-Em14-3-3均能在BCG中热诱导表达，而不能在大肠杆菌Top10中表达，并且表达的EmⅡ/3和Em14-3-3重组蛋白都具有特异的抗原性。 ⑤多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3疫苗、BCG-Em14-3-3疫苗以及混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗鼻腔粘膜接种免疫BALB/c小鼠均能诱导产生较强的特异性CD4+Th1型细胞免疫、体液免疫和微弱的CD8+CTL细胞免疫应答。 ⑥多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3疫苗、BCG-Em14-3-3疫苗以及混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗鼻腔粘膜诱导BALB/c小鼠产生的保护力优于皮下注射。 四、创新点 ①本项目率先构建了多房棘球绦虫重组质粒pBCG-EmⅡ/3和pBCG-Em14-3-3。 ②本项目率先构建了多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3疫苗、BCG-Em14-3-3疫苗以及混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗，为泡型棘球蚴病的预防和治疗提供了一种新途径。 ③本项目率先研究了多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3疫苗、BCG-Em14-3-3疫苗以及混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗免疫BALB/c小鼠诱导产生的保护力及其保护性免疫机制，从而为这些疫苗的开发利用奠定了基础。 五、社会效益与经济效益 ①在学术带头人培养方面：陈雅棠研究员为重庆市内科学（传染病学）学术带头人，李文桂研究员为国家自然科学基金项目评审专家、国家科技部科技期刊评审专家、中华医学会热带病与寄生虫学专业委员会委员、中华医学会地方病学专业委员会委员、中华医学会重庆市感染性疾病专业委员会委员、《国际检验医学杂志》编辑委员会委员、《中国病原生物学杂志》编辑委员会委员和《热带医学杂志》编辑委员会委员。 ②在研究生培养方面：本课题培养了硕士研究生5名（王鸿、朱佑明、曾莉蓉、杨梅和谢婷），其中2005级硕士研究生杨梅同学为重庆医科大学2008年度校级优秀硕士毕业生，其硕士研究生学位论文为重庆医科大学2008年度校级优秀硕士毕业论文；2003级硕士研究生王鸿同学的硕士研究生学位论文为重庆医科大学2006年度校级优秀硕士毕业论文；2003级硕士研究生朱佑明同学的硕士研究生学位论文为重庆医科大学2006年度校级优秀硕士毕业论文。 ③本课题成功构建了多房棘球绦虫重组BCG-EmII/3疫苗和BCG-Em14-3-3疫苗，为泡型包虫病的预防和治疗提供了一种新途径。 ④本课题深入研究了多房棘球绦虫重组BCG-EmII/3疫苗、重组BCG-Em14-3-3疫苗以及混合重组BCG-EmII/3和重组BCG-Em14-3-3疫苗对小鼠的保护力及其免疫机制。 ⑤本课题在国内外核心期刊发表研究论文46篇。 六、与国内外同类技术比较 据国内外报道现有重组BCG疫苗种类，细菌方面有表达肺炎球菌表面蛋白A的rBCG-PspA疫苗，表达单核细胞增多性李斯特菌溶血素O的rBCG-LLO疫苗，表达百日咳杆菌毒素的rBCG-PT疫苗,表达破伤风梭菌毒素的rBCG-TTC疫苗，表达搏氏疏螺旋体外表面蛋白的rBCG-OspA疫苗；病毒方面有表达麻疹病毒核壳蛋白的rBCG-N疫苗，表达人类免疫缺陷病毒gag、Env、nef和pol蛋白的rBCG-HIV-I-gag/env/nef/pol疫苗，表达猴免疫缺陷病毒gag或nef蛋白的rBCG-SIV-gag/nef疫苗；细胞因子方面有表达IL-2、IFN-γ或GM-CSF的rBCG-IL-2/IFN-γ/GM-CSF疫苗；寄生虫病方面有表达硕大利什曼原虫表面蛋白酶GP63的rBCG-GP63疫苗，表达恶性疟原虫和约氏疟原虫环子孢子蛋白或裂殖子表面蛋白的rBCG-CSP/MSP疫苗，表达曼氏血吸虫97KD副肌球蛋白的rBCG-Sm97疫苗，表达曼氏血吸虫、埃及血吸虫和日本血吸虫26KD谷胱甘肽-S-转移酶的rBCG-GST疫苗。 国内外未见多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3疫苗和BCG-Em14-3-3疫苗的相关报道。 七、推广应用情况 将多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3疫苗、BCG-Em14-3-3疫苗以及混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗用于泡型棘球蚴病的预防具有十分广阔的推广应用前景。本课题组计划从2010年1月在四川省甘孜洲进行该疫苗免疫人群的现场实验，根据该疫苗的防治效果，然后再在四川、云南或广西等西南地区乃至全国各地进行推广。

一、任务来源 重庆市卫生局科研项目。 项目编号：03-2-099。 项目名称：多房棘球绦虫重组BCG-EmII/3-10疫苗构建及其免疫机制研究。 二、研究背景 泡型包虫病是由于患者在狩猎过程中误食多房棘球绦虫的虫卵或孕节所致。虫卵中六钩蚴进入机体后在宿主肠内孵出，钻入小肠，经血循环至肝脏发育成泡球蚴。泡球蚴长期寄生在宿主体内，宿主针对泡球蚴将产生持久的免疫应答，因此，保护性抗原的研究方向应定位在多房棘球绦虫的幼虫—泡球蚴。 已知EmII/3-10位于泡球蚴的原头蚴生发层和育囊囊壁上，编码EmII/3-10的基因在质粒pAR3038表达水平较高，Gottstein等发现携带EmII/3-10抗原编码基因的重组伤寒沙门氏杆菌疫苗皮下注射和口服免疫C57BL/6J鼠，可引起免疫鼠脾淋巴细胞明显增殖及抗EmII/3-10特异性抗体升高，提示EmII/3-10是一种较好的保护性抗原分子，因此，本课题将EmII/3-10蛋白分子列为重点研究对象。 重组BCG疫苗是一种新型疫苗，具有许多优点：所表达的靶抗原不需纯化，可直接用于免疫注射，免去了蛋白质后处理的复杂工序；单次接种即可诱导机体产生针对靶抗原的免疫反应；运用分子生物学手段，通过对不同靶抗原的剪切和拼接，可使新型疫苗理想化；BCG本身作为一种强免疫佐剂，可提高宿主的免疫力；在人类近2×109个免疫接种者中证明BCG用于人体是安全的；它是WHO推荐使用的两种出生时即可接种的活疫苗之一；在世界范围内分布着BCG接种网，价格低廉，易于保存，适于大量生产。因此构建多房棘球绦虫重组BCG疫苗用于泡型包虫病防治可能具有十分诱人的前景，定会产生巨大的经济和社会效益。 本课题拟将多房棘球绦虫的原头蚴中的EmII/3-10抗原编码基因克隆到大肠杆菌—构建多房棘球绦虫重组BCG-EmII/3-10疫苗，研究EmII/3-10在重组BCG中的表达情况，然后将重组BCG-EmII/3-10疫苗接种BALB/c鼠，多房棘球绦虫原头蚴攻击后研究其保护性免疫机制，从而为防治多房棘球绦虫提供一种有效的疫苗。 三、研究结果 ①通过RT-PCR成功地扩增出EmⅡ/3和Em14-3-3抗原编码基因。 ②成功构建了多房棘球绦虫重组质粒pBCG-EmⅡ/3和pBCG-Em14-3-3。 ③成功构建了多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3疫苗、BCG-Em14-3-3疫苗以及混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗。 ④多房棘球绦虫重组质粒pBCG-EmⅡ/3和pBCG-Em14-3-3均能在BCG中热诱导表达，而不能在大肠杆菌Top10中表达，并且表达的EmⅡ/3和Em14-3-3重组蛋白都具有特异的抗原性。 ⑤多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3疫苗、BCG-Em14-3-3疫苗以及混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗鼻腔粘膜接种免疫BALB/c小鼠均能诱导产生较强的特异性CD4+Th1型细胞免疫、体液免疫和微弱的CD8+CTL细胞免疫应答。 ⑥多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3疫苗、BCG-Em14-3-3疫苗以及混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗鼻腔粘膜诱导BALB/c小鼠产生的保护力优于皮下注射。 四、创新点 ①本项目率先构建了多房棘球绦虫重组质粒pBCG-EmⅡ/3和pBCG-Em14-3-3。 ②本项目率先构建了多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3疫苗、BCG-Em14-3-3疫苗以及混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗，为泡型棘球蚴病的预防和治疗提供了一种新途径。 ③本项目率先研究了多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3疫苗、BCG-Em14-3-3疫苗以及混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗免疫BALB/c小鼠诱导产生的保护力及其保护性免疫机制，从而为这些疫苗的开发利用奠定了基础。 五、社会效益与经济效益 ①在学术带头人培养方面：陈雅棠研究员为重庆市内科学（传染病学）学术带头人，李文桂研究员为国家自然科学基金项目评审专家、国家科技部科技期刊评审专家、中华医学会热带病与寄生虫学专业委员会委员、中华医学会地方病学专业委员会委员、中华医学会重庆市感染性疾病专业委员会委员、《国际检验医学杂志》编辑委员会委员、《中国病原生物学杂志》编辑委员会委员和《热带医学杂志》编辑委员会委员。 ②在研究生培养方面：本课题培养了硕士研究生5名（王鸿、朱佑明、曾莉蓉、杨梅和谢婷），其中2005级硕士研究生杨梅同学为重庆医科大学2008年度校级优秀硕士毕业生，其硕士研究生学位论文为重庆医科大学2008年度校级优秀硕士毕业论文；2003级硕士研究生王鸿同学的硕士研究生学位论文为重庆医科大学2006年度校级优秀硕士毕业论文；2003级硕士研究生朱佑明同学的硕士研究生学位论文为重庆医科大学2006年度校级优秀硕士毕业论文。 ③本课题成功构建了多房棘球绦虫重组BCG-EmII/3疫苗和BCG-Em14-3-3疫苗，为泡型包虫病的预防和治疗提供了一种新途径。 ④本课题深入研究了多房棘球绦虫重组BCG-EmII/3疫苗、重组BCG-Em14-3-3疫苗以及混合重组BCG-EmII/3和重组BCG-Em14-3-3疫苗对小鼠的保护力及其免疫机制。 ⑤本课题在国内外核心期刊发表研究论文46篇。 六、与国内外同类技术比较 据国内外报道现有重组BCG疫苗种类，细菌方面有表达肺炎球菌表面蛋白A的rBCG-PspA疫苗，表达单核细胞增多性李斯特菌溶血素O的rBCG-LLO疫苗，表达百日咳杆菌毒素的rBCG-PT疫苗,表达破伤风梭菌毒素的rBCG-TTC疫苗，表达搏氏疏螺旋体外表面蛋白的rBCG-OspA疫苗；病毒方面有表达麻疹病毒核壳蛋白的rBCG-N疫苗，表达人类免疫缺陷病毒gag、Env、nef和pol蛋白的rBCG-HIV-I-gag/env/nef/pol疫苗，表达猴免疫缺陷病毒gag或nef蛋白的rBCG-SIV-gag/nef疫苗；细胞因子方面有表达IL-2、IFN-γ或GM-CSF的rBCG-IL-2/IFN-γ/GM-CSF疫苗；寄生虫病方面有表达硕大利什曼原虫表面蛋白酶GP63的rBCG-GP63疫苗，表达恶性疟原虫和约氏疟原虫环子孢子蛋白或裂殖子表面蛋白的rBCG-CSP/MSP疫苗，表达曼氏血吸虫97KD副肌球蛋白的rBCG-Sm97疫苗，表达曼氏血吸虫、埃及血吸虫和日本血吸虫26KD谷胱甘肽-S-转移酶的rBCG-GST疫苗。 国内外未见多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3疫苗和BCG-Em14-3-3疫苗的相关报道。 七、推广应用情况 将多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3疫苗、BCG-Em14-3-3疫苗以及混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗用于泡型棘球蚴病的预防具有十分广阔的推广应用前景。本课题组计划从2010年1月在四川省甘孜洲进行该疫苗免疫人群的现场实验，根据该疫苗的防治效果，然后再在四川、云南或广西等西南地区乃至全国各地进行推广。