题目：负载BMP与VEGF的PDLLA材料修复骨缺损的实验研究 　　任务来源：自选 　　完成单位：日照市人民医院 　　课题由来：由于某种因素如外伤、感染、肿瘤切除或先天性疾病等而使骨丧失了一些骨质，形成较大的间隙，称为骨缺损。骨缺损一直是矫形外科领域的一个疑难且具有挑战性的课题。目前，治疗骨缺损的方法有采用自体骨、异体骨、组织工程化骨进行手术治疗；运用基因治疗法和物理疗法以加速骨质的生长愈合。应用生长因子和组织工程技术治疗骨缺损是目前研究的热点，其可行性还在积极的探索中。自体骨移植无疑是很好的方法，但由于供体区域骨量的有限以及取骨所带来的一系列并发症(如疼痛、感染、出血及疤痕等)使得异体骨的需求不断增加以补充甚至代替自体骨。然而，异体骨的移植又带来了传播疾病(肝炎、爱滋病等)的风险性和免度排斥的不利结局。该课题为解决以上问题，对骨缺损修复方法及材料应用进行创新研究。 　　研究目的： 　　1、采用兔骨髓组织，通过梯度离心法获取骨髓基质细胞，在体外培养传代，观察该细胞的生物学特性及成骨能力。 　　2、研究新型多孔超聚消旋聚乳酸(PDLLA)支架材料的体外细胞相容性，探讨制备负载BMP及VEGF的PDLLA支架材料可行性。 　　3、评价同时负载BMP及VEGF的PDLLA支架材料的体内成骨能力，进行兔桡骨缺损的修复试验并探讨在动物体内成骨的量效关系，以得到一种较好的可吸收骨构建材料。 　　研究方法： 　　1、抽取新西兰兔骨髓，用全骨髓培养法获取单核细胞，经条件培养液体外诱导、扩增。通过倒置相差显微镜、细胞染色、扫描电镜观察细胞生长及细胞与材料的附着情况，并绘制细胞生长曲线(MTT法)检测各组细胞增殖和细胞周期变化情况。采用碱性磷酸酶染色(ALP)和I型胶原免疫组化染色进行骨髓基质细胞成骨特性的鉴定。 　　2、贴壁法培养兔骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs)，经体外矿化诱导培养、扩增后，再与实验组A(含5mgBMP与100?gVEGF微球PDLLA)、实验组B(活性玻璃陶瓷材料BGC)及对照组c(空白PDLLA)分别进行体外复合培养；并通过定性及定量检测细胞在材料表面的粘附能力、增殖活力，验证细胞材料复合体的成骨活性，比较分析各组支架材料之间的差异。 　　3、制备新西兰大白兔右挠骨中段12mm骨缺损实验模型，随机分为实验组、对照组和空白组，实验组植入同时负载5mgBMP、VEGF微球及1×106个已向成骨细胞诱导的BMSCs的PDLLA、对照组植入负载5mgBMP及1×106个已向成骨细胞诱导的BMSCs的PDLLA，空白组仅制作骨缺损模型，不植入任何成骨材料。术后对动物进行大体观察、摄X线片观察各组不同时相骨缺损修复情况、比较不同时相的骨缺损区X线阻射密度、并于术后第4，8，12周取出骨缺损区标本进行大体观察和组织学切片观察，图像分析骨小梁的生数量，并取第12周标本进行生物力学检测。 　　研究结果： 　　1、兔骨髓基质细胞经条件培养液体外诱导、扩增，骨髓基质细胞ALP染色阳性率超过80％，体外培养的细胞能合成较多量I型胶原，均表明所获得的骨髓基质细胞是成熟的成骨细胞，可以做为骨组织工程中一种良好的种子细胞。 　　2、兔BMSCs在三组支架材料的表面均能生长，经体外诱导后在支架材料的表面形成钙结节，实验组A与B细胞的粘附及增殖能力均强于对照组(P＜0.05)。 　　3、负载BMP及VEGF的PDLLA支架材料12周三点折弯强度为(52.38±2.56)MPa，纯PDLLA为(29.83±3.14)MPa，相比差异有显著性(P＜0.01)，负载BMP及VEGF的PDLLA与PDLLA在术后各时期骨形成评分高于对照组(P＜0.01)。 　　研究结论： 　　1、所获得的骨髓基质细胞是成熟的成骨细胞，可以作为骨组织工程中一种良好的种子细胞。 　　2、兔BMSCs与新型多孔PDLLA支架材料有良好的细胞相容性，可作为骨缺损的组织工程材料。 　　3、负载BMP及VEGF的PDLLA支架材料具有良好的生物相容性和可吸收性，修复兔挠骨12mm骨缺损的效果明显优于单纯负载BMP的PDLLA支架材料， 是一种有临床应用前景的骨移植材料。 　　关键词：超聚消旋乳酸；骨形态发生蛋白；血管内皮生长因子；骨缺损；骨髓基质干细胞。 　　结论及理论突破 　　1、所获得的骨髓基质细胞是成熟的成骨细胞，可以作为骨组织工程中一种良好的种子细胞。 　　2、兔BMSCs与新型多孔PDLLA支架材料有良好的细胞相容性，可作为骨缺损的组织工程材料。 　　3、负载BMP及VEGF的PDLLA支架材料具有良好的生物相容性和可吸收性，修复兔挠骨12mm骨缺损的效果明显优于单纯负载BMP的PDLLA支架材料， 是一种有临床应用前景的骨移植材料。 　　创新点：本课题为一系列研究，从动物细胞的培养，到临床应用研究，具有很好的连贯性和实用性。创新点主要有： 　　1、用多孔PDLLA作为支架材料制作人工骨。 　　2、首次将两种细胞因子同时负载到已复合成骨细胞的多孔PDLLA支架材料中促进成骨性功效。 　　3、应用骨髓基质细胞作为骨组织工程中的种子细胞。 　　本研究证实： 　　1、所获得的骨髓基质细胞是成熟的成骨细胞，可以做为骨组织工程中一种良好的种子细胞。　 　　2、兔BMSCs与负载BMP及VEGF的新型多孔PDLLA支架材料有良好的细胞相容性，可作为骨缺损的组织工程材料。 　　3、负载BMP及VEGF的PDLLA支架材料具有良好的生物相容性和可吸收性，修复兔挠骨骨缺损的效果明显优于负载单一细胞因子的PDLLA支架材料， 是一种有临床应用前景的骨移植材料。

　　题目：负载BMP与VEGF的PDLLA材料修复骨缺损的实验研究 　　任务来源：自选 　　完成单位：日照市人民医院 　　课题由来：由于某种因素如外伤、感染、肿瘤切除或先天性疾病等而使骨丧失了一些骨质，形成较大的间隙，称为骨缺损。骨缺损一直是矫形外科领域的一个疑难且具有挑战性的课题。目前，治疗骨缺损的方法有采用自体骨、异体骨、组织工程化骨进行手术治疗；运用基因治疗法和物理疗法以加速骨质的生长愈合。应用生长因子和组织工程技术治疗骨缺损是目前研究的热点，其可行性还在积极的探索中。自体骨移植无疑是很好的方法，但由于供体区域骨量的有限以及取骨所带来的一系列并发症(如疼痛、感染、出血及疤痕等)使得异体骨的需求不断增加以补充甚至代替自体骨。然而，异体骨的移植又带来了传播疾病(肝炎、爱滋病等)的风险性和免度排斥的不利结局。该课题为解决以上问题，对骨缺损修复方法及材料应用进行创新研究。 　　研究目的： 　　1、采用兔骨髓组织，通过梯度离心法获取骨髓基质细胞，在体外培养传代，观察该细胞的生物学特性及成骨能力。 　　2、研究新型多孔超聚消旋聚乳酸(PDLLA)支架材料的体外细胞相容性，探讨制备负载BMP及VEGF的PDLLA支架材料可行性。 　　3、评价同时负载BMP及VEGF的PDLLA支架材料的体内成骨能力，进行兔桡骨缺损的修复试验并探讨在动物体内成骨的量效关系，以得到一种较好的可吸收骨构建材料。 　　研究方法： 　　1、抽取新西兰兔骨髓，用全骨髓培养法获取单核细胞，经条件培养液体外诱导、扩增。通过倒置相差显微镜、细胞染色、扫描电镜观察细胞生长及细胞与材料的附着情况，并绘制细胞生长曲线(MTT法)检测各组细胞增殖和细胞周期变化情况。采用碱性磷酸酶染色(ALP)和I型胶原免疫组化染色进行骨髓基质细胞成骨特性的鉴定。 　　2、贴壁法培养兔骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs)，经体外矿化诱导培养、扩增后，再与实验组A(含5mgBMP与100?gVEGF微球PDLLA)、实验组B(活性玻璃陶瓷材料BGC)及对照组c(空白PDLLA)分别进行体外复合培养；并通过定性及定量检测细胞在材料表面的粘附能力、增殖活力，验证细胞材料复合体的成骨活性，比较分析各组支架材料之间的差异。 　　3、制备新西兰大白兔右挠骨中段12mm骨缺损实验模型，随机分为实验组、对照组和空白组，实验组植入同时负载5mgBMP、VEGF微球及1×106个已向成骨细胞诱导的BMSCs的PDLLA、对照组植入负载5mgBMP及1×106个已向成骨细胞诱导的BMSCs的PDLLA，空白组仅制作骨缺损模型，不植入任何成骨材料。术后对动物进行大体观察、摄X线片观察各组不同时相骨缺损修复情况、比较不同时相的骨缺损区X线阻射密度、并于术后第4，8，12周取出骨缺损区标本进行大体观察和组织学切片观察，图像分析骨小梁的生数量，并取第12周标本进行生物力学检测。 　　研究结果： 　　1、兔骨髓基质细胞经条件培养液体外诱导、扩增，骨髓基质细胞ALP染色阳性率超过80％，体外培养的细胞能合成较多量I型胶原，均表明所获得的骨髓基质细胞是成熟的成骨细胞，可以做为骨组织工程中一种良好的种子细胞。 　　2、兔BMSCs在三组支架材料的表面均能生长，经体外诱导后在支架材料的表面形成钙结节，实验组A与B细胞的粘附及增殖能力均强于对照组(P＜0.05)。 　　3、负载BMP及VEGF的PDLLA支架材料12周三点折弯强度为(52.38±2.56)MPa，纯PDLLA为(29.83±3.14)MPa，相比差异有显著性(P＜0.01)，负载BMP及VEGF的PDLLA与PDLLA在术后各时期骨形成评分高于对照组(P＜0.01)。 　　研究结论： 　　1、所获得的骨髓基质细胞是成熟的成骨细胞，可以作为骨组织工程中一种良好的种子细胞。 　　2、兔BMSCs与新型多孔PDLLA支架材料有良好的细胞相容性，可作为骨缺损的组织工程材料。 　　3、负载BMP及VEGF的PDLLA支架材料具有良好的生物相容性和可吸收性，修复兔挠骨12mm骨缺损的效果明显优于单纯负载BMP的PDLLA支架材料， 是一种有临床应用前景的骨移植材料。 　　关键词：超聚消旋乳酸；骨形态发生蛋白；血管内皮生长因子；骨缺损；骨髓基质干细胞。 　　结论及理论突破 　　1、所获得的骨髓基质细胞是成熟的成骨细胞，可以作为骨组织工程中一种良好的种子细胞。 　　2、兔BMSCs与新型多孔PDLLA支架材料有良好的细胞相容性，可作为骨缺损的组织工程材料。 　　3、负载BMP及VEGF的PDLLA支架材料具有良好的生物相容性和可吸收性，修复兔挠骨12mm骨缺损的效果明显优于单纯负载BMP的PDLLA支架材料， 是一种有临床应用前景的骨移植材料。 　　创新点：本课题为一系列研究，从动物细胞的培养，到临床应用研究，具有很好的连贯性和实用性。创新点主要有： 　　1、用多孔PDLLA作为支架材料制作人工骨。 　　2、首次将两种细胞因子同时负载到已复合成骨细胞的多孔PDLLA支架材料中促进成骨性功效。 　　3、应用骨髓基质细胞作为骨组织工程中的种子细胞。 　　本研究证实： 　　1、所获得的骨髓基质细胞是成熟的成骨细胞，可以做为骨组织工程中一种良好的种子细胞。　 　　2、兔BMSCs与负载BMP及VEGF的新型多孔PDLLA支架材料有良好的细胞相容性，可作为骨缺损的组织工程材料。 　　3、负载BMP及VEGF的PDLLA支架材料具有良好的生物相容性和可吸收性，修复兔挠骨骨缺损的效果明显优于负载单一细胞因子的PDLLA支架材料， 是一种有临床应用前景的骨移植材料。