此课题2005年立项，2008年完成，共研究了三年时间。三年来，在医院的大力支持、医学专家的指导和同行们的共同努力下，我们克服了种种困难，做了大量工作，取得了很大成果，有了新的突破，研究工作基本结束。 　　1、深部真菌的培养鉴定方法及生化反应试验 　　此项研究收集了2005年1月～2007年12月间深部真菌感染患者的标本（血液、痰液、中段尿液、分泌物），共做细菌培养9834份，分离病原菌4120株，检出深部真菌585株。全部试验按照全国临床检验操作规程进行，方法是将标本同时接种Sabouraud培养基和CHROMagar显色培养基，经35℃培养24～48小时分离培养后，观察菌落生长情况，酵母样真菌在Sabouraud培养基上菌落呈奶油色、馅饼状、光滑；在CHROMagar真菌显色培养基上菌落呈现不同的颜色。如：白色假丝酵母菌呈绿色，克柔假丝酵母菌呈粉红色，光滑球似酵母菌呈紫色，热带假丝酵母菌呈蓝紫色，其它假丝酵母菌呈白色。CHROMagar真菌显色培养基可将真菌分离纯化，取分离纯化的菌落涂片，革兰染色观察真菌形态，显微镜下可见到革兰氏染色阳性(着色不均匀)、圆形或卵圆形菌体孢子及假菌丝。同时做以下实验： 　　（1）血清芽管试验：用无菌试管，加入人血清0.2毫升，接种被检真菌，混匀后置37℃水浴箱中，2～3小时后用白金耳取出含菌血清，置于载玻片上进行镜检。有芽管形成为试验阳性。如：白色假丝酵母菌血清芽管试验阳性，热带假丝酵母菌血清芽管试验阴性。 　　（2）厚膜孢子试验：将真菌接种在玉米－吐温80琼脂平板上，30℃培养72小时，显微镜下观察形态：假菌丝中隔部伴有成簇的圆形分生孢子，顶端有厚壁的厚膜孢子为试验阳性。如：白色假丝酵母菌厚膜孢子试验阳性，热带假丝酵母菌厚膜孢子试验阴性。 　　生化反应试验用法国生物－梅里埃API 20C AUX生化鉴定板鉴定到种，按说明书进行操作。原理：假丝酵母菌能发酵某种糖，就一定能同化该糖，故只需做那些不被发酵糖的同化试验。糖发酵试验是将真菌接种糖发酵管，25℃孵育观察72小时，对不发酵或弱发酵管可延长10天或2～4周。同化试验所有的基础培养基含(NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCI2·2H2O、NaCl和酵母浸膏，试验时分别加入各种糖，同时以葡萄糖和基础培养基作对照，观察有无酵母菌生长或液体培养基是否变混浊。若有生长或变浑浊为阳性。鉴定板中生化反应测定的名称有：GLU、GLY、2KG、ARA、XYL、ADO、XLT、GAL、INO、RAF、SOR、MDG、NAG、CEL、LAC、MAL、SAC、TRE、MLZ、HYPHAE共20种，通过酵母菌ATB数码分类鉴定系统，观察酵母样真菌的生化反应和特性。 　　2、酵母样真菌体外药物敏感试验 　　试验原理： 　　提供两种以上有相当活性的抗真菌药物的可信测量方法；和体内的活性具有相关性，可预测治疗的效果；可用来监控敏感群体菌株的耐药性发生；可预期研究新药的潜在治疗效能。我们按照美国国家临床实验室标准化委员会标准，使用肉汤稀释法(K-B方法)、Neo-Sensitab真菌药敏药片（WHO推荐、丹麦ROSCO公司产品）测定酵母样真菌的体外药敏试验。　　试验过程： 　　是将分离纯化后的菌落配成0.5麦氏浊度的接种液后，倾注于药敏平板表面，将平皿倾斜摇动涂布均匀，然后用移液管吸走多余的液体，35℃干燥10分钟，贴药敏纸片，经35℃培养24～48小时后取出，用卡尺量取抑菌环直径，根据标准判断抗真菌药物的敏感性。药敏纸片选用：制霉菌素、两性霉素B、氟康唑、酮康唑、咪康唑、5-氟胞嘧啶、特比奈芬共七种。ROSCO纸片扩散法结果判读参照NCCLS纸片扩散法进行，以白色假丝酵母菌ATCC64548和近平滑假丝酵母菌ATCC22019作为质控菌株。 　　3、抗真菌药物的疗效观察 　　疗效观察是按照卫生部颁发的抗菌药物临床指导原则，分为痊愈、显效、进步、无效四类。痊愈：症状体征、实验室检查及病原学检查四项全部恢复正常；显效：病情明显好转，但四项中一项未完全恢复正常；进步：用药后病情有好转，但不明显；无效：用药72h临床症状无改善或加重。痊愈与显效合计为“有效”。据此计算有效率。数据的统计用北京宏桥公司虚拟实验室统计软件和WHONET5.3软件进行。 　　4、研究结果 　　本课题通过对医院条件致病性深部真菌的分布、种类的鉴定及对抗真菌药物的敏感和耐药现状的调查研究，以标准菌株作为质量控制菌株，探讨快速培养真菌的方法，提高检测的阳性率和准确率。通过实验观察我们发现：使用CHROMagar真菌显色培养基，可以缩短真菌培养鉴定时间，是一种快速培养真菌的方法。研究还发现热带假丝酵母菌的芽管试验比较迟缓，需要孵育6小时以上，有的可有芽管生成。而且有些热带假丝酵母菌在接种到CHROMagar真菌显色培养基上，培养18～24小时出现的颜色为浅紫色，48小时后则变为蓝紫色。呈现白色的多为近平滑假丝酵母菌、葡萄芽假丝酵母菌等，需进一步用API 20C AUX生化鉴定板鉴定到种。 　　研究结果显示：从检出的4120株病原菌中深部真菌占585株，检出率14.2﹪。585株真菌分为12种，10种为假丝酵母菌(558株)占95.4﹪；另2种分别为曲霉菌(22株)占3.8﹪，毛霉菌(5株)占0.9﹪。白色假丝酵母菌(350株)占59.8﹪，非白色假丝酵母菌(235株)占40.2﹪。2005～2007年检出真菌种类分别为7种(190株)、12种(197株)、12种(198株)，临床感染的真菌仍以白色假丝酵母菌为主，非白色假丝酵母菌的感染有上升趋势。 　　通过体外药物敏感试验我们发现：抗真菌药物对酵母菌的耐药性分布具有明显的种间差异。两性霉素B、制霉菌素、氟胞嘧啶、酮康唑的耐药率较低，分别为0.8﹪、0.6﹪、4.7 ﹪、1.4﹪，是抗真菌首选药物；而且酵母菌对唑类药物存在交叉耐药现象。酵母菌对特比萘芬的耐药率较高为55.8﹪，其中热带假丝酵母菌对特比萘芬的耐药率最高达到85﹪以上。因此，特比萘芬不适用于热带假丝酵母菌感染的治疗，酵母菌对特比萘芬的耐药率较高问题值得进一步研究。 　　氟康唑对大多数酵母菌具有良好的体外抗菌活性，敏感率为84.2﹪；但克柔假丝酵母菌和光滑球拟酵母菌对氟康唑的耐药率较高，这与国外报道相一致。克柔假丝酵母菌和光滑球拟酵母菌对氟康唑具有天然耐药性，因此临床上不能选用氟康唑来治疗。两性霉素B对所有酵母菌都具有很好的体外抗菌活性，尤其是对氟康唑耐药性较高的克柔假丝酵母菌和光滑球拟酵母菌也有较好活性，是治疗氟康唑耐药真菌的首选药物。 　　随着临床上氟康唑的大量应用，本试验检出2株（0.6﹪）耐氟康唑和6株（1.7﹪）对氟康唑中介的白色假丝酵母菌，这与氟康唑对白色假丝酵母菌100﹪敏感的报道不相符合，提示耐氟康唑的白色假丝酵母菌有增加趋势，应引起临床高度重视。有关体外药敏试验与体内临床疗效的一致性还需进一步研究探讨。 通过试验和调查发现：抗真菌药物两性霉素B与氟康唑比较，两性霉素B比氟康唑具有更高的体外抗菌活性，是治疗氟康唑耐药真菌的首选药物。由于两性霉素B的毒副作用限制了临床的使用，只要临床根据患者的实际情况，采取必要措施，正确使用，其副作用患者是可以耐受的，而且疗效比较显著。 　　我们认为，对于多重感染的患者，由于长期接受抗真菌药物治疗，将导致耐药性真菌寄生和感染现象的增加。因此建议有严重免疫功能低下的患者，应避免进行唑类药物的长期治疗，并且临床医生应根据菌种鉴定和药敏试验结果合理使用抗真菌药物，减轻患者的经济负担。 　　5、国内外研究现状和发展趋势 　　二十一世纪真菌感染及抗真菌药物的研究已成为世界具有挑战性课题。随着现代医学的迅速发展，先进诊疗技术的引进，广谱抗生素、细胞毒性药物以及免疫抑制剂的广泛应用，使条件致病性深部真菌的感染日益增多并趋向复杂化，是常导致患者死亡的主要原因之一。由于临床抗真菌药物的使用，真菌耐药性也愈来愈严重，并产生了一些耐药菌株，给临床的治疗带来了困难，因此逐渐引起国内外广大医务工作者的高度重视。目前国外在真菌流行病学方面，已发展出一些切实可行的分子生物学方法来区别一些特殊菌株，用于菌株分型、鉴定并研究其亲缘关系。这些技术主要包括聚合酶链反应（PCR）派生出的一系列菌株分型技术，如RAPD、RFLP、PFGE、SSCP等。在临床检验工作中，直接镜检法和培养检查法是形态学检查的基本方法，只有两种方法相结合才能提高对病原菌检出的阳性率，更好地为临床服务。近几年条件致病性真菌感染不断增加，难以排除少见真菌和特殊类型真菌感染的可能性。因此一些新致病菌种的发现和正确的鉴定是非常重要的。我们研究的条件致病性深部真菌的培养鉴定方法探讨及耐药菌株在形态学和生物化学特性的变化这一课题目前国内未见报道。 　　6、研究项目的创新点和意义 　　本课题通过对真菌感染患者的标本进行真菌的分离培养、菌种鉴定、生化反应及体外抗真菌药物敏感试验并对其结果加以分析，从而了解真菌菌种的分布及其对抗真菌药物的敏感性、耐药性，从理论上研究真菌在药物作用下的生长、代谢状况，通过对酵母样真菌中的某种热带假丝酵母菌的生化特性和对抗真菌药物的敏感性、耐药性的研究，我们发现了这种真菌在CHROMagar真菌显色培养基上菌落颜色的变化；在血清芽管试验中的迟缓反应和对抗真菌药物特比萘芬的耐药性较高的问题，在国内未见报道。而且我们对抗真菌药物氟康唑耐药的菌株进行其它抗真菌药物的筛选，选择出敏感率高、价格相对较低的抗真菌药物两性霉素B，从理论上为临床治疗真菌感染提供可靠依据。对指导临床合理使用抗真菌药物，达到及时发现，及早治疗的目的，对真菌的诊断、治疗和预防有着重大的现实意义。临床医师对有真菌感染的患者应迅速采取治疗措施，使用敏感率高、价格适中的抗真菌药物，为患者节省开支，减轻经济负担具有一定的实际意义。

　　此课题2005年立项，2008年完成，共研究了三年时间。三年来，在医院的大力支持、医学专家的指导和同行们的共同努力下，我们克服了种种困难，做了大量工作，取得了很大成果，有了新的突破，研究工作基本结束。 　　1、深部真菌的培养鉴定方法及生化反应试验 　　此项研究收集了2005年1月～2007年12月间深部真菌感染患者的标本（血液、痰液、中段尿液、分泌物），共做细菌培养9834份，分离病原菌4120株，检出深部真菌585株。全部试验按照全国临床检验操作规程进行，方法是将标本同时接种Sabouraud培养基和CHROMagar显色培养基，经35℃培养24～48小时分离培养后，观察菌落生长情况，酵母样真菌在Sabouraud培养基上菌落呈奶油色、馅饼状、光滑；在CHROMagar真菌显色培养基上菌落呈现不同的颜色。如：白色假丝酵母菌呈绿色，克柔假丝酵母菌呈粉红色，光滑球似酵母菌呈紫色，热带假丝酵母菌呈蓝紫色，其它假丝酵母菌呈白色。CHROMagar真菌显色培养基可将真菌分离纯化，取分离纯化的菌落涂片，革兰染色观察真菌形态，显微镜下可见到革兰氏染色阳性(着色不均匀)、圆形或卵圆形菌体孢子及假菌丝。同时做以下实验： 　　（1）血清芽管试验：用无菌试管，加入人血清0.2毫升，接种被检真菌，混匀后置37℃水浴箱中，2～3小时后用白金耳取出含菌血清，置于载玻片上进行镜检。有芽管形成为试验阳性。如：白色假丝酵母菌血清芽管试验阳性，热带假丝酵母菌血清芽管试验阴性。 　　（2）厚膜孢子试验：将真菌接种在玉米－吐温80琼脂平板上，30℃培养72小时，显微镜下观察形态：假菌丝中隔部伴有成簇的圆形分生孢子，顶端有厚壁的厚膜孢子为试验阳性。如：白色假丝酵母菌厚膜孢子试验阳性，热带假丝酵母菌厚膜孢子试验阴性。 　　生化反应试验用法国生物－梅里埃API 20C AUX生化鉴定板鉴定到种，按说明书进行操作。原理：假丝酵母菌能发酵某种糖，就一定能同化该糖，故只需做那些不被发酵糖的同化试验。糖发酵试验是将真菌接种糖发酵管，25℃孵育观察72小时，对不发酵或弱发酵管可延长10天或2～4周。同化试验所有的基础培养基含(NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCI2·2H2O、NaCl和酵母浸膏，试验时分别加入各种糖，同时以葡萄糖和基础培养基作对照，观察有无酵母菌生长或液体培养基是否变混浊。若有生长或变浑浊为阳性。鉴定板中生化反应测定的名称有：GLU、GLY、2KG、ARA、XYL、ADO、XLT、GAL、INO、RAF、SOR、MDG、NAG、CEL、LAC、MAL、SAC、TRE、MLZ、HYPHAE共20种，通过酵母菌ATB数码分类鉴定系统，观察酵母样真菌的生化反应和特性。 　　2、酵母样真菌体外药物敏感试验 　　试验原理： 　　提供两种以上有相当活性的抗真菌药物的可信测量方法；和体内的活性具有相关性，可预测治疗的效果；可用来监控敏感群体菌株的耐药性发生；可预期研究新药的潜在治疗效能。我们按照美国国家临床实验室标准化委员会标准，使用肉汤稀释法(K-B方法)、Neo-Sensitab真菌药敏药片（WHO推荐、丹麦ROSCO公司产品）测定酵母样真菌的体外药敏试验。　　试验过程： 　　是将分离纯化后的菌落配成0.5麦氏浊度的接种液后，倾注于药敏平板表面，将平皿倾斜摇动涂布均匀，然后用移液管吸走多余的液体，35℃干燥10分钟，贴药敏纸片，经35℃培养24～48小时后取出，用卡尺量取抑菌环直径，根据标准判断抗真菌药物的敏感性。药敏纸片选用：制霉菌素、两性霉素B、氟康唑、酮康唑、咪康唑、5-氟胞嘧啶、特比奈芬共七种。ROSCO纸片扩散法结果判读参照NCCLS纸片扩散法进行，以白色假丝酵母菌ATCC64548和近平滑假丝酵母菌ATCC22019作为质控菌株。 　　3、抗真菌药物的疗效观察 　　疗效观察是按照卫生部颁发的抗菌药物临床指导原则，分为痊愈、显效、进步、无效四类。痊愈：症状体征、实验室检查及病原学检查四项全部恢复正常；显效：病情明显好转，但四项中一项未完全恢复正常；进步：用药后病情有好转，但不明显；无效：用药72h临床症状无改善或加重。痊愈与显效合计为“有效”。据此计算有效率。数据的统计用北京宏桥公司虚拟实验室统计软件和WHONET5.3软件进行。 　　4、研究结果 　　本课题通过对医院条件致病性深部真菌的分布、种类的鉴定及对抗真菌药物的敏感和耐药现状的调查研究，以标准菌株作为质量控制菌株，探讨快速培养真菌的方法，提高检测的阳性率和准确率。通过实验观察我们发现：使用CHROMagar真菌显色培养基，可以缩短真菌培养鉴定时间，是一种快速培养真菌的方法。研究还发现热带假丝酵母菌的芽管试验比较迟缓，需要孵育6小时以上，有的可有芽管生成。而且有些热带假丝酵母菌在接种到CHROMagar真菌显色培养基上，培养18～24小时出现的颜色为浅紫色，48小时后则变为蓝紫色。呈现白色的多为近平滑假丝酵母菌、葡萄芽假丝酵母菌等，需进一步用API 20C AUX生化鉴定板鉴定到种。 　　研究结果显示：从检出的4120株病原菌中深部真菌占585株，检出率14.2﹪。585株真菌分为12种，10种为假丝酵母菌(558株)占95.4﹪；另2种分别为曲霉菌(22株)占3.8﹪，毛霉菌(5株)占0.9﹪。白色假丝酵母菌(350株)占59.8﹪，非白色假丝酵母菌(235株)占40.2﹪。2005～2007年检出真菌种类分别为7种(190株)、12种(197株)、12种(198株)，临床感染的真菌仍以白色假丝酵母菌为主，非白色假丝酵母菌的感染有上升趋势。 　　通过体外药物敏感试验我们发现：抗真菌药物对酵母菌的耐药性分布具有明显的种间差异。两性霉素B、制霉菌素、氟胞嘧啶、酮康唑的耐药率较低，分别为0.8﹪、0.6﹪、4.7 ﹪、1.4﹪，是抗真菌首选药物；而且酵母菌对唑类药物存在交叉耐药现象。酵母菌对特比萘芬的耐药率较高为55.8﹪，其中热带假丝酵母菌对特比萘芬的耐药率最高达到85﹪以上。因此，特比萘芬不适用于热带假丝酵母菌感染的治疗，酵母菌对特比萘芬的耐药率较高问题值得进一步研究。 　　氟康唑对大多数酵母菌具有良好的体外抗菌活性，敏感率为84.2﹪；但克柔假丝酵母菌和光滑球拟酵母菌对氟康唑的耐药率较高，这与国外报道相一致。克柔假丝酵母菌和光滑球拟酵母菌对氟康唑具有天然耐药性，因此临床上不能选用氟康唑来治疗。两性霉素B对所有酵母菌都具有很好的体外抗菌活性，尤其是对氟康唑耐药性较高的克柔假丝酵母菌和光滑球拟酵母菌也有较好活性，是治疗氟康唑耐药真菌的首选药物。 　　随着临床上氟康唑的大量应用，本试验检出2株（0.6﹪）耐氟康唑和6株（1.7﹪）对氟康唑中介的白色假丝酵母菌，这与氟康唑对白色假丝酵母菌100﹪敏感的报道不相符合，提示耐氟康唑的白色假丝酵母菌有增加趋势，应引起临床高度重视。有关体外药敏试验与体内临床疗效的一致性还需进一步研究探讨。 通过试验和调查发现：抗真菌药物两性霉素B与氟康唑比较，两性霉素B比氟康唑具有更高的体外抗菌活性，是治疗氟康唑耐药真菌的首选药物。由于两性霉素B的毒副作用限制了临床的使用，只要临床根据患者的实际情况，采取必要措施，正确使用，其副作用患者是可以耐受的，而且疗效比较显著。 　　我们认为，对于多重感染的患者，由于长期接受抗真菌药物治疗，将导致耐药性真菌寄生和感染现象的增加。因此建议有严重免疫功能低下的患者，应避免进行唑类药物的长期治疗，并且临床医生应根据菌种鉴定和药敏试验结果合理使用抗真菌药物，减轻患者的经济负担。 　　5、国内外研究现状和发展趋势 　　二十一世纪真菌感染及抗真菌药物的研究已成为世界具有挑战性课题。随着现代医学的迅速发展，先进诊疗技术的引进，广谱抗生素、细胞毒性药物以及免疫抑制剂的广泛应用，使条件致病性深部真菌的感染日益增多并趋向复杂化，是常导致患者死亡的主要原因之一。由于临床抗真菌药物的使用，真菌耐药性也愈来愈严重，并产生了一些耐药菌株，给临床的治疗带来了困难，因此逐渐引起国内外广大医务工作者的高度重视。目前国外在真菌流行病学方面，已发展出一些切实可行的分子生物学方法来区别一些特殊菌株，用于菌株分型、鉴定并研究其亲缘关系。这些技术主要包括聚合酶链反应（PCR）派生出的一系列菌株分型技术，如RAPD、RFLP、PFGE、SSCP等。在临床检验工作中，直接镜检法和培养检查法是形态学检查的基本方法，只有两种方法相结合才能提高对病原菌检出的阳性率，更好地为临床服务。近几年条件致病性真菌感染不断增加，难以排除少见真菌和特殊类型真菌感染的可能性。因此一些新致病菌种的发现和正确的鉴定是非常重要的。我们研究的条件致病性深部真菌的培养鉴定方法探讨及耐药菌株在形态学和生物化学特性的变化这一课题目前国内未见报道。 　　6、研究项目的创新点和意义 　　本课题通过对真菌感染患者的标本进行真菌的分离培养、菌种鉴定、生化反应及体外抗真菌药物敏感试验并对其结果加以分析，从而了解真菌菌种的分布及其对抗真菌药物的敏感性、耐药性，从理论上研究真菌在药物作用下的生长、代谢状况，通过对酵母样真菌中的某种热带假丝酵母菌的生化特性和对抗真菌药物的敏感性、耐药性的研究，我们发现了这种真菌在CHROMagar真菌显色培养基上菌落颜色的变化；在血清芽管试验中的迟缓反应和对抗真菌药物特比萘芬的耐药性较高的问题，在国内未见报道。而且我们对抗真菌药物氟康唑耐药的菌株进行其它抗真菌药物的筛选，选择出敏感率高、价格相对较低的抗真菌药物两性霉素B，从理论上为临床治疗真菌感染提供可靠依据。对指导临床合理使用抗真菌药物，达到及时发现，及早治疗的目的，对真菌的诊断、治疗和预防有着重大的现实意义。临床医师对有真菌感染的患者应迅速采取治疗措施，使用敏感率高、价格适中的抗真菌药物，为患者节省开支，减轻经济负担具有一定的实际意义。