一、 简要技术说明： 　　任务来源：自选课题。 　　利用未成熟树突状细胞（imDC）诱导免疫耐受，为大面积深度烧伤病人的异体皮肤移植提供了一条良好的思路。然而imDC本身并不稳定，大面积烧伤病人体内存在的LPS、TNF-α等物质能促进其迅速发育成熟，从而引起免疫排斥。我们在前期的研究中发现，在体外利用人外周血源单个核细胞诱导、扩增的imDC与IL-10共培养后，能够抵抗LPS、TNF-α的促成熟作用，仍保持其不成熟的特性。但是，大面积烧伤均为突发事故，而我们在临床工作中所应用的异体皮肤则来自死后的捐献者，低温冻存虽是保护细胞的良好方法，但其冷冻保护剂二甲基亚砜（DMSO）具有细胞毒性作用，且与其浓度有关。因此如何保存所培养的细胞，为皮肤移植提供足够数量的性质稳定的供者源的未成熟DC，是临床推广应用未成熟DC诱导皮肤移植免疫耐受的前题。 　　本次实验中将羟乙基淀粉（HES）与DMSO联合应用，降低DMSO的使用浓度，观察其对所冻存的具有抗成熟特性的未成熟DC活性的影响，以期为未成熟DC的临床应用提供保存方法。经烟台市科学技术情报研究所查新（编号：200905350308）国内未见“根据白介素-10对APC功能的影响，实现未成熟树突状细胞抗成熟的特性，并利用羟乙基淀粉联合二甲基亚砜（DMSO），对抗成熟特性的未成熟树突状细胞的低温保存进行研究”方面的文献报道。 　　人外周血来源的单个核细胞通过细胞因子组合体外诱导、扩增，并经白介素-10处理后所获得的具有抗成熟特性的未成熟DC，通过联合使用5﹪DMSO和6﹪HES作为冷冻保护剂，采用非程控性降温技术进行冷冻保存，冻存复苏后的台盼蓝拒染回收率＞80﹪，与传统的单纯应用10﹪DMSO作为冷冻保护剂相比无明显差异；其生物学特性与冻存前相比无显著性差异，即细胞仍表现为未成熟状态。且经LPS、TNF-α等促成熟物质刺激后，在MLR中亦不能刺激同种异体的T细胞增殖。说明采用该方法冻存的IL-10-imDC可以保持其抗成熟特性。 　　二、主要技术性能指标： 　　1.人外周血来源的抗成熟特性的未成熟DC的体外扩增及鉴定：联合应用细胞因子组合rhGM-CSF和rhIL-4体外诱导、扩增人外周血分离的单个核细胞，于培养第7d同时加入rhIL-10联合培养，将收获细胞从形态学、细胞表面标志物以及功能方面进行分析。 　　2.人外周血来源的抗成熟特性的未成熟DC的体外保存：将获得的细胞应用两种不同方法进行低温冻存，复温后进行形态学、免疫表型及功能的检测。

　　一、 简要技术说明： 　　任务来源：自选课题。 　　利用未成熟树突状细胞（imDC）诱导免疫耐受，为大面积深度烧伤病人的异体皮肤移植提供了一条良好的思路。然而imDC本身并不稳定，大面积烧伤病人体内存在的LPS、TNF-α等物质能促进其迅速发育成熟，从而引起免疫排斥。我们在前期的研究中发现，在体外利用人外周血源单个核细胞诱导、扩增的imDC与IL-10共培养后，能够抵抗LPS、TNF-α的促成熟作用，仍保持其不成熟的特性。但是，大面积烧伤均为突发事故，而我们在临床工作中所应用的异体皮肤则来自死后的捐献者，低温冻存虽是保护细胞的良好方法，但其冷冻保护剂二甲基亚砜（DMSO）具有细胞毒性作用，且与其浓度有关。因此如何保存所培养的细胞，为皮肤移植提供足够数量的性质稳定的供者源的未成熟DC，是临床推广应用未成熟DC诱导皮肤移植免疫耐受的前题。 　　本次实验中将羟乙基淀粉（HES）与DMSO联合应用，降低DMSO的使用浓度，观察其对所冻存的具有抗成熟特性的未成熟DC活性的影响，以期为未成熟DC的临床应用提供保存方法。经烟台市科学技术情报研究所查新（编号：200905350308）国内未见“根据白介素-10对APC功能的影响，实现未成熟树突状细胞抗成熟的特性，并利用羟乙基淀粉联合二甲基亚砜（DMSO），对抗成熟特性的未成熟树突状细胞的低温保存进行研究”方面的文献报道。 　　人外周血来源的单个核细胞通过细胞因子组合体外诱导、扩增，并经白介素-10处理后所获得的具有抗成熟特性的未成熟DC，通过联合使用5﹪DMSO和6﹪HES作为冷冻保护剂，采用非程控性降温技术进行冷冻保存，冻存复苏后的台盼蓝拒染回收率＞80﹪，与传统的单纯应用10﹪DMSO作为冷冻保护剂相比无明显差异；其生物学特性与冻存前相比无显著性差异，即细胞仍表现为未成熟状态。且经LPS、TNF-α等促成熟物质刺激后，在MLR中亦不能刺激同种异体的T细胞增殖。说明采用该方法冻存的IL-10-imDC可以保持其抗成熟特性。 　　二、主要技术性能指标： 　　1.人外周血来源的抗成熟特性的未成熟DC的体外扩增及鉴定：联合应用细胞因子组合rhGM-CSF和rhIL-4体外诱导、扩增人外周血分离的单个核细胞，于培养第7d同时加入rhIL-10联合培养，将收获细胞从形态学、细胞表面标志物以及功能方面进行分析。 　　2.人外周血来源的抗成熟特性的未成熟DC的体外保存：将获得的细胞应用两种不同方法进行低温冻存，复温后进行形态学、免疫表型及功能的检测。