任务来源： “中国HIV流行株全基因序列、表位蛋白分析及传播因素研究”项目是2000年启动的自选项目，由华北煤炭医学院承担并完成。 所属技术领域： 传染病预防（33024）。 研究内容： 该项目利用健康人巨噬细胞（PBMC）分离中国HIV-1 B|优势流行株CNHN24，通过PBMC细胞和MT4细胞混合培养，使得CNHN24能够在传代细胞株MT4上良好生长，解决了从患者体内分离的T淋巴细胞嗜性HIV-1不能在巨噬细胞株上培养的难题，摸索出利用传代细胞系分离培养HIV-1的新方法。 该项目采用超长片段DNA扩增技术，以HIV-1 CNHN24株前基因组DNA为模板，通过增加模板量、降低培养温度、减少循环次数和利用低拷贝质粒pLG338等手段克服了长期困扰科研人员的超长片段基因组克隆的基因缺失、重排等不稳定现象，在国内外首次完成中国HIV-1流行株的全长基因组克隆。将制备的感染性克隆导入PBMC细胞和MT4细胞能够成功复制HIV-1病毒，培养48小时后即可在培养上清中检出HIV-1 P24抗原，能够反映HIV-1复制水平。证实了本项目构建的中国HIV-1 B|亚型流行株感染性克隆可为抗HIV-1的药物筛选、疫苗研究提供技术平台。 该项目利用BioEdit、Clustal X软件，分析了中国HIV-1B|流行株Vif区的基因组特征。首次发现我国HIV-1 B|优势流行株的Vif基因区90～93位的特定氨基酸基序为“RRKR”，157～160位氨基酸特定基序为“KRRK”，为我国的HIV治疗提供新的靶点，为抗HIV药物的研发提供新的靶标。 该项目利用国际最新研制的裂殖酵母蛋白质相互作用研究平台，克服了研究平台在HEK293细胞系探讨APOBEC3G、UBA2及其融合蛋白在抑制Vif介导的HIV感染中的作用大小。在国内外首次证明APOBEC3G与UBA2的融合蛋白对Vif介导的HIV感染抑制作用远大于单独的APOBEC3G蛋白，同时揭示这种融合蛋白是通过降低Vif对蛋白酶的降解而起作用的。 该项目利用HIV感染者血清成功地从噬菌体展示随机12肽库中筛选出了。 简要技术说明及主要技术性能指标 位于HIV-1 gp41膜蛋白的高亲和力B细胞抗原表位，并利用M13噬菌体PⅢ蛋白的Ⅰ～Ⅱ结构域作为骨架，以可溶性形式表达了两个抗原表位的串联体。这种结构域完整复制了表位筛选时的抗原抗体结合特性，克服了原核表达表位抗原的分子结构失真的缺陷，为HIV-1感染者的筛选和诊断提供了新的抗原制备手段，为开发HIV-1抗体诊断试剂打开了新思路。 该项目在中国河南、河北等省农村地区开展了艾滋病病毒（HIV）异性性传播的特点及其影响因素研究。通过对87对至少一方HIV呈阳性、有稳定婚姻和正常性生活的夫妻进行访谈，测定病毒载量和D4/CD8细胞计数。采用敏感性问题调查技术克服了中国人对性问题回答的不准确性难题。发现了中国有稳定婚姻关系的夫妻中HIV-1性传播的频率很低，而且是HIV-1的三种传播途径中效率最低的，为HIV-1的性传播途径研究中提出新的见解。 该项目培养了博士研究生2名、硕士研究生2名。课题组撰写论文15篇，其中SCI收录论文3篇，中华级期刊发表论文6篇，国家专业核心期刊发表论文6篇，发表的论文先后被28篇相关论文引用。该成果已在唐山市CDC、华北煤炭医学院、唐山市人民医院、传染病院等医院应用，为大量的就诊患者提供了科学的HIV-1预防控制信息，带来显著的社会效益。 与国内外同类技术综合比较 艾滋病病毒（HIV）分为HIV-1和HIV-2两个型别。根据膜蛋白基因env区核酸和氨基酸的同源性，HIV-1又可分为M、N和O三个亚群，M亚群中包括A-J 10个亚型。我国HIV-1流行株主要包括HIV-1 B、C、E三个亚型，近几年，有关HIV-1 A、D、F亚型及HIV-2的报道逐渐增多。由于HIV基因的高度变异性，在HIV的传播中产生了许多变异株，不同的传播途径和传染来源形成了某些人群和地区的特异亚型分布。 HIV-1B|亚型为我国的优势亚型，由东南亚地区传入我国，并在我国的部分市、县有偿献血员中传播流行。研究人员已经报道了不同地区、不同亚型的全基因序列，没有中国HIV-1 B|亚型流行株的全基因组研究，对流行株的基因功能研究受到限制，因此本项目开展了中国HIV-1 B|亚型优势流行株的全基因组克隆，并利用这一克隆建立感染性克隆，进一步研究基因功能。 Vif是HIV-1的调控基因，可影响HIV-1的感染结局。有关HIV-1 Vif区的基因研究国外开展较多，发现了不同的特征氨基酸序列，但是由于HIV-1的突变频率非常高，同一亚型的HIV-1感染者的HIV基因序列的同源性只有80％左右，因此不同地区的HIV-1流行株基因序列差异很大，有必要开展本地区的特异序列研究。本研究发现的Vif蛋白在90～93位的KKRK基序是中国HIV-1B|亚型特异序列，具有自身的独特识别意义，这一序列对病毒复制和感染力产生影响，对于保持Vif蛋白的功能，确保病毒在细胞内的正常组装和复制是有利的。 HIV-1抗体检测关系到感染者的筛检和诊断，诊断抗原的制备成为重要问题。国内外利用基因表达蛋白制备的HIV-1抗体初筛和诊断试剂已经发展到第四代，但是其成本仍然较高，很多抗原来自国外，缺乏针对国内优势流行株的抗原，为准确、可靠检测中国的HIV-1感染者提出一定的难题。但是，单纯一个表位的表达蛋白，无论是用于HIV的检测，还是用于HIV疫苗的研究，均不能达到理想的效果。如果将HIV不同编码区的优势表位进行串联表达，则有可能解决这一矛盾。本项目利用噬菌体随机展示文库筛选表位，将两个中和抗体表位串联，利用M13噬菌体结构域维持表达融合蛋白，可保持正确的折叠构象，维持蛋白的结合活性，在国内外尚属首创。 研究证实全世界大约70％～80％HIV感染者是通过性途径感染的，其中异性性接触传播占60％～70％，男性同性恋传播占5％～10％。未来全球艾滋病（AIDS）流行的负担主要取决于HIV性传播减轻的程度。有专家推测HIV的异性性传播也将是我国AIDS流行的主要原因和预防与控制的主要目标，但是，本研究却发现在我国的农村地区HIV-1的异性性传播频率很低，这一问题是否带有普遍性值得我们进一步探讨。同时我们也发现，HIV的异性性传播受行为和生物学因素的影响比较大，干预和控制的难度也很大。研究HIV异性性传播特点和影响因素，对于深入认识我国AIDS的流行规律、预测流行趋势、提出有效的干预措施具有重要的意义。 简要技术说明及主要技术性能指标 关键技术、创新点 关键技术： 1.HIV-1全长基因组克隆构建及其稳定性； 2.感染性克隆转染细胞后产生病毒的能力和水平； 3.在农村开展HIV-1异性性传播这种敏感性问题调查结果的可靠性。 创新点： 本项目在国内外首次： 1.采用M13噬菌体结构域进行HIV-1中和表位蛋白的串联表达； 2.发现中国HIV感染长期不进展者Vif区的特异性多肽基序“KRRK”； 3.发现APOBEC3G与UBA2融合蛋白可有效抑制Vif介导的HIV感染； 4.完成中国HIV-1 B|优势流行株全基因组克隆、基因序列分析。 作用意义： 本课题在成功分离中国HIV-1 B|优势流行株的基础上，构建了中国HIV-1 CNHN24株全基因组克隆和感染性克隆，为抗HIV-1的药物筛选、疫苗研究提供了技术平台。发现我国HIV-1 B|感染长期不进展者Vif区氨基酸的特定基序为“KRRK”和APOBEC3G与UBA2的融合蛋白可有效地抑制Vif介导的HIV感染为HIV-1的基因功能研究奠定了基础。利用噬菌体PⅢ蛋白结构域串联表达两个表位蛋白，为HIV-1诊断试剂的研制提供新的手段。发现HIV-1在中国的夫妻间异性性传播频率很低，为HIV-1传播途径研究提出了新的见解。本项目在HIV-1的感染者检测和临床咨询中具有显著的经济效益和社会效益。 下一步的工作设想： 利用建立的感染性克隆，通过基因敲除技术，深入研究其他基因在HIV感染、复制、毒力等方面的功能，为抗HIV药物的筛选建立合适的平台。利用串联表达的HIV-1中和表位探讨开发新型筛检试剂的可行性。深入探讨异性性传播对我国HIV-1流行趋势和规律的影响。 推广措施及应用前景 我们将利用参加学术活动、举办培训班、讲座等形式推广该项技术。 本课题在成功分离中国HIV-1 B|优势流行株的基础上，构建了中国HIV-1 CNHN24株全基因组克隆和感染性克隆，为抗HIV-1的药物筛选、疫苗研究提供了技术平台。发现我国HIV-1 B|感染长期不进展者Vif区氨基酸的特定基序为“KRRK”和APOBEC3G与UBA2的融合蛋白可有效地抑制Vif介导的HIV感染为HIV-1的基因功能研究奠定了基础。利用噬菌体PⅢ蛋白结构域串联表达两个表位蛋白，为HIV-1诊断试剂的研制提供新的手段。发现HIV-1在中国的夫妻间异性性传播频率很低，为HIV-1传播途径研究提出了新的见解，对学科建设具有强大的支持作用，必将在临床上得到广泛的应用。

任务来源： “中国HIV流行株全基因序列、表位蛋白分析及传播因素研究”项目是2000年启动的自选项目，由华北煤炭医学院承担并完成。 所属技术领域： 传染病预防（33024）。 研究内容： 该项目利用健康人巨噬细胞（PBMC）分离中国HIV-1 B|优势流行株CNHN24，通过PBMC细胞和MT4细胞混合培养，使得CNHN24能够在传代细胞株MT4上良好生长，解决了从患者体内分离的T淋巴细胞嗜性HIV-1不能在巨噬细胞株上培养的难题，摸索出利用传代细胞系分离培养HIV-1的新方法。 该项目采用超长片段DNA扩增技术，以HIV-1 CNHN24株前基因组DNA为模板，通过增加模板量、降低培养温度、减少循环次数和利用低拷贝质粒pLG338等手段克服了长期困扰科研人员的超长片段基因组克隆的基因缺失、重排等不稳定现象，在国内外首次完成中国HIV-1流行株的全长基因组克隆。将制备的感染性克隆导入PBMC细胞和MT4细胞能够成功复制HIV-1病毒，培养48小时后即可在培养上清中检出HIV-1 P24抗原，能够反映HIV-1复制水平。证实了本项目构建的中国HIV-1 B|亚型流行株感染性克隆可为抗HIV-1的药物筛选、疫苗研究提供技术平台。 该项目利用BioEdit、Clustal X软件，分析了中国HIV-1B|流行株Vif区的基因组特征。首次发现我国HIV-1 B|优势流行株的Vif基因区90～93位的特定氨基酸基序为“RRKR”，157～160位氨基酸特定基序为“KRRK”，为我国的HIV治疗提供新的靶点，为抗HIV药物的研发提供新的靶标。 该项目利用国际最新研制的裂殖酵母蛋白质相互作用研究平台，克服了研究平台在HEK293细胞系探讨APOBEC3G、UBA2及其融合蛋白在抑制Vif介导的HIV感染中的作用大小。在国内外首次证明APOBEC3G与UBA2的融合蛋白对Vif介导的HIV感染抑制作用远大于单独的APOBEC3G蛋白，同时揭示这种融合蛋白是通过降低Vif对蛋白酶的降解而起作用的。 该项目利用HIV感染者血清成功地从噬菌体展示随机12肽库中筛选出了。 简要技术说明及主要技术性能指标 位于HIV-1 gp41膜蛋白的高亲和力B细胞抗原表位，并利用M13噬菌体PⅢ蛋白的Ⅰ～Ⅱ结构域作为骨架，以可溶性形式表达了两个抗原表位的串联体。这种结构域完整复制了表位筛选时的抗原抗体结合特性，克服了原核表达表位抗原的分子结构失真的缺陷，为HIV-1感染者的筛选和诊断提供了新的抗原制备手段，为开发HIV-1抗体诊断试剂打开了新思路。 该项目在中国河南、河北等省农村地区开展了艾滋病病毒（HIV）异性性传播的特点及其影响因素研究。通过对87对至少一方HIV呈阳性、有稳定婚姻和正常性生活的夫妻进行访谈，测定病毒载量和D4/CD8细胞计数。采用敏感性问题调查技术克服了中国人对性问题回答的不准确性难题。发现了中国有稳定婚姻关系的夫妻中HIV-1性传播的频率很低，而且是HIV-1的三种传播途径中效率最低的，为HIV-1的性传播途径研究中提出新的见解。 该项目培养了博士研究生2名、硕士研究生2名。课题组撰写论文15篇，其中SCI收录论文3篇，中华级期刊发表论文6篇，国家专业核心期刊发表论文6篇，发表的论文先后被28篇相关论文引用。该成果已在唐山市CDC、华北煤炭医学院、唐山市人民医院、传染病院等医院应用，为大量的就诊患者提供了科学的HIV-1预防控制信息，带来显著的社会效益。 与国内外同类技术综合比较 艾滋病病毒（HIV）分为HIV-1和HIV-2两个型别。根据膜蛋白基因env区核酸和氨基酸的同源性，HIV-1又可分为M、N和O三个亚群，M亚群中包括A-J 10个亚型。我国HIV-1流行株主要包括HIV-1 B、C、E三个亚型，近几年，有关HIV-1 A、D、F亚型及HIV-2的报道逐渐增多。由于HIV基因的高度变异性，在HIV的传播中产生了许多变异株，不同的传播途径和传染来源形成了某些人群和地区的特异亚型分布。 HIV-1B|亚型为我国的优势亚型，由东南亚地区传入我国，并在我国的部分市、县有偿献血员中传播流行。研究人员已经报道了不同地区、不同亚型的全基因序列，没有中国HIV-1 B|亚型流行株的全基因组研究，对流行株的基因功能研究受到限制，因此本项目开展了中国HIV-1 B|亚型优势流行株的全基因组克隆，并利用这一克隆建立感染性克隆，进一步研究基因功能。 Vif是HIV-1的调控基因，可影响HIV-1的感染结局。有关HIV-1 Vif区的基因研究国外开展较多，发现了不同的特征氨基酸序列，但是由于HIV-1的突变频率非常高，同一亚型的HIV-1感染者的HIV基因序列的同源性只有80％左右，因此不同地区的HIV-1流行株基因序列差异很大，有必要开展本地区的特异序列研究。本研究发现的Vif蛋白在90～93位的KKRK基序是中国HIV-1B|亚型特异序列，具有自身的独特识别意义，这一序列对病毒复制和感染力产生影响，对于保持Vif蛋白的功能，确保病毒在细胞内的正常组装和复制是有利的。 HIV-1抗体检测关系到感染者的筛检和诊断，诊断抗原的制备成为重要问题。国内外利用基因表达蛋白制备的HIV-1抗体初筛和诊断试剂已经发展到第四代，但是其成本仍然较高，很多抗原来自国外，缺乏针对国内优势流行株的抗原，为准确、可靠检测中国的HIV-1感染者提出一定的难题。但是，单纯一个表位的表达蛋白，无论是用于HIV的检测，还是用于HIV疫苗的研究，均不能达到理想的效果。如果将HIV不同编码区的优势表位进行串联表达，则有可能解决这一矛盾。本项目利用噬菌体随机展示文库筛选表位，将两个中和抗体表位串联，利用M13噬菌体结构域维持表达融合蛋白，可保持正确的折叠构象，维持蛋白的结合活性，在国内外尚属首创。 研究证实全世界大约70％～80％HIV感染者是通过性途径感染的，其中异性性接触传播占60％～70％，男性同性恋传播占5％～10％。未来全球艾滋病（AIDS）流行的负担主要取决于HIV性传播减轻的程度。有专家推测HIV的异性性传播也将是我国AIDS流行的主要原因和预防与控制的主要目标，但是，本研究却发现在我国的农村地区HIV-1的异性性传播频率很低，这一问题是否带有普遍性值得我们进一步探讨。同时我们也发现，HIV的异性性传播受行为和生物学因素的影响比较大，干预和控制的难度也很大。研究HIV异性性传播特点和影响因素，对于深入认识我国AIDS的流行规律、预测流行趋势、提出有效的干预措施具有重要的意义。 简要技术说明及主要技术性能指标 关键技术、创新点 关键技术： 1.HIV-1全长基因组克隆构建及其稳定性； 2.感染性克隆转染细胞后产生病毒的能力和水平； 3.在农村开展HIV-1异性性传播这种敏感性问题调查结果的可靠性。 创新点： 本项目在国内外首次： 1.采用M13噬菌体结构域进行HIV-1中和表位蛋白的串联表达； 2.发现中国HIV感染长期不进展者Vif区的特异性多肽基序“KRRK”； 3.发现APOBEC3G与UBA2融合蛋白可有效抑制Vif介导的HIV感染； 4.完成中国HIV-1 B|优势流行株全基因组克隆、基因序列分析。 作用意义： 本课题在成功分离中国HIV-1 B|优势流行株的基础上，构建了中国HIV-1 CNHN24株全基因组克隆和感染性克隆，为抗HIV-1的药物筛选、疫苗研究提供了技术平台。发现我国HIV-1 B|感染长期不进展者Vif区氨基酸的特定基序为“KRRK”和APOBEC3G与UBA2的融合蛋白可有效地抑制Vif介导的HIV感染为HIV-1的基因功能研究奠定了基础。利用噬菌体PⅢ蛋白结构域串联表达两个表位蛋白，为HIV-1诊断试剂的研制提供新的手段。发现HIV-1在中国的夫妻间异性性传播频率很低，为HIV-1传播途径研究提出了新的见解。本项目在HIV-1的感染者检测和临床咨询中具有显著的经济效益和社会效益。 下一步的工作设想： 利用建立的感染性克隆，通过基因敲除技术，深入研究其他基因在HIV感染、复制、毒力等方面的功能，为抗HIV药物的筛选建立合适的平台。利用串联表达的HIV-1中和表位探讨开发新型筛检试剂的可行性。深入探讨异性性传播对我国HIV-1流行趋势和规律的影响。 推广措施及应用前景 我们将利用参加学术活动、举办培训班、讲座等形式推广该项技术。 本课题在成功分离中国HIV-1 B|优势流行株的基础上，构建了中国HIV-1 CNHN24株全基因组克隆和感染性克隆，为抗HIV-1的药物筛选、疫苗研究提供了技术平台。发现我国HIV-1 B|感染长期不进展者Vif区氨基酸的特定基序为“KRRK”和APOBEC3G与UBA2的融合蛋白可有效地抑制Vif介导的HIV感染为HIV-1的基因功能研究奠定了基础。利用噬菌体PⅢ蛋白结构域串联表达两个表位蛋白，为HIV-1诊断试剂的研制提供新的手段。发现HIV-1在中国的夫妻间异性性传播频率很低，为HIV-1传播途径研究提出了新的见解，对学科建设具有强大的支持作用，必将在临床上得到广泛的应用。