一、任务来源 项目来源及编号：两项国家自然科学基金面上项目(NO.30170270，30200063)。 二、应用领域和技术原理 应用领域：生物活性多肽对高分子骨基质材料表面修饰的基础理论 技术原理： 在骨组织工程学研究中，种子细胞在骨基质材料上的特异性粘附和增殖是其获得良好生物活性的首要条件。骨基质材料的表面特性直接影响材料的细胞亲和性。借助于材料表面修饰技术可以提升材料-种子细胞间相互作用，促进种子细胞的粘附、增殖和分化，为构建组织工程化人工骨创造有利条件。生物活性RGD多肽作为细胞粘附序列，通过与细胞表面整合素受体特异性结合促进细胞对基质的粘附。研究发现，RGD多肽GRGDSPC表面修饰骨基质材料可使其获得特定的生物学信号和细胞特异性识别位点，显著促进种子细胞粘附及分化。 骨髓基质干细胞(BMSCs)具有成骨分化潜能，增殖迅速、表型稳定，是目前首选的骨组织工程种子细胞，但BMSCs向成骨细胞转化需要特定生长因子(GF)的诱导与调控。因而，如何使RGD多肽修饰的骨基质材料获得良好的成骨诱导活性是构建组织工程化人工骨的另一关键。 转化生长因子 1(TGF-1)是目前诱导调控BMSCs成骨定向分化的首选GF，但外源性TGF-1活性低、半衰期短，需反复给药、且价格非常昂贵，其应用受到限制。近年来，将原位组织工程学(in-situ tissue engineering)与基因工程技术有机结合，通过基因活化基质(gene- activated matrix, GAM)原位介导GF基因转入种子细胞，利用转基因细胞持续高效表达高生物活性的内源性GF，调控种子细胞定向分化，有望很好地解决这一问题。 本研究中我们设计合成一种新型双功能RGD多肽-(K)16GRGDSPC，它既能通过整合素受体介导细胞特异性粘附，又能作为靶向性非病毒载体介导基因转染。通过本体化学改性的方法，将亲水性的PEG和具有生物活性基团的ASP同时引入PLGA分子链，制备新型三嵌段高分子骨基质材料PLGA-[ASP-PEG]。将RGD多肽GRGDSPC和(K)16GRGDSPC分别共价固定对PLGA-[ASP-PEG]表面修饰，赋予其生物学信号和细胞特异性识别位点，介导BMSCs特异性高效粘附。(K)16GRGDSPC表面修饰的高分子骨基质材料通过(K)16静电包裹外源TGF-1基因并介导基因在BMSCs内的高效转染和表达，研制出具有完全自主知识产权的载基因仿生骨基质材料。这种新型GAM具有三维多孔结构，能为细胞的生长增殖和分化提供良好的支撑；同时具有良好的表面活性，能特异性地介导BMSCs粘附；还具有良好的骨诱导活性，可通过原位介导TGF- 1基因转染与表达从而调控BMSCs成骨定向分化。研究发现，载基因仿生骨基质材料复合BMSCs构建组织工程化骨可显著提高骨缺损修复质量。 三、成果的创造性、先进性 本课题利用生物活性多肽对高分子骨基质材料表面修饰并将其应用于骨组织工程学领域的研究在国内外未见文献报道，具有明显创新性和先进性。表现为： 1、将聚乙二醇(PEG)和天冬氨酸(ASP)与PLGA共聚，合成聚(丙交酯-co-乙交酯)-天冬氨酸-聚乙二醇[PLGA-(ASP-PEG)n]三嵌段共聚物，制备PLGA-(ASP- PEG)多孔骨基质材料，其体内外生物相容性良好； 2、合成RGD肽GRGDSPC并将其共价接枝对高分子骨基质材料表面修饰，并将其应用于骨组织工程学领域，能显著促进骨组织工程种子细胞BMSCs粘附及分化； 3、设计合成一种具有双重功能的新型RGD肽(K)16GRGDSPC，该肽既能作为整合素受体的配体介导BMSCs高效粘附，又能作为靶向性非病毒载体介导基因转染，优化其介导外源TGF-β1基因转染BMSCs的各项最佳条件，并将其共价接枝对高分子骨基质材料表面修饰，显著促进BMSCs粘附、增殖及分化； 4、通过双功能多肽(K)16GRGDSPC对高分子骨基质材料表面修饰并与外源基因复合，构建一种新型基因活化基质，该基因活化基质不仅促进细胞粘附和功能表达，且介导基因转染的能力大大提高，显著改善传统基因活化基质将基因简单涂覆在基质材料表面导致转染效率低下的不足，为原位组织工程学提供了一种新技术； 5、将外源TGF-β1基因通过载基因仿生骨基质材料原位转入骨组织工程种子细胞BMSCs，并将BMSCs与载基因基质材料复合移植修复骨缺损，取得良好效果。 四、成果意义及推广应用前景 本研究中将RGD多肽GRGDSPC和(K)16GRGDSPC分别共价固定对高分子骨基质材料表面修饰，赋予其生物学信号和细胞特异性识别位点，介导BMSCs特异性高效粘附，为基质材料表面修饰基础理论研究提供了两种理想的生物信号分子。同时，(K)16GRGDSPC作为一种非病毒载体在转基因技术领域有广阔的应用前景。 本研究制备一种新型三嵌段高分子骨基质材料PLGA-[ASP-PEG]，并研制出载基因仿生骨基质材料，复合BMSCs构建组织工程化人工骨可显著提高骨缺损修复质量，为骨修复材料严重短缺这一问题的根本解决带来了可能。组织工程相关产品正逐步形成高附加值的高科技产业，市场潜力巨大。本项目可研制开发具有更好修复质量和良好生物学活性的系列组织工程化人工骨修复材料，创新性和竞争力强，临床适应证广，故具有极为广阔的临床应用前景。

一、任务来源 项目来源及编号：两项国家自然科学基金面上项目(NO.30170270，30200063)。 二、应用领域和技术原理 应用领域：生物活性多肽对高分子骨基质材料表面修饰的基础理论 技术原理： 在骨组织工程学研究中，种子细胞在骨基质材料上的特异性粘附和增殖是其获得良好生物活性的首要条件。骨基质材料的表面特性直接影响材料的细胞亲和性。借助于材料表面修饰技术可以提升材料-种子细胞间相互作用，促进种子细胞的粘附、增殖和分化，为构建组织工程化人工骨创造有利条件。生物活性RGD多肽作为细胞粘附序列，通过与细胞表面整合素受体特异性结合促进细胞对基质的粘附。研究发现，RGD多肽GRGDSPC表面修饰骨基质材料可使其获得特定的生物学信号和细胞特异性识别位点，显著促进种子细胞粘附及分化。 骨髓基质干细胞(BMSCs)具有成骨分化潜能，增殖迅速、表型稳定，是目前首选的骨组织工程种子细胞，但BMSCs向成骨细胞转化需要特定生长因子(GF)的诱导与调控。因而，如何使RGD多肽修饰的骨基质材料获得良好的成骨诱导活性是构建组织工程化人工骨的另一关键。 转化生长因子 1(TGF-1)是目前诱导调控BMSCs成骨定向分化的首选GF，但外源性TGF-1活性低、半衰期短，需反复给药、且价格非常昂贵，其应用受到限制。近年来，将原位组织工程学(in-situ tissue engineering)与基因工程技术有机结合，通过基因活化基质(gene- activated matrix, GAM)原位介导GF基因转入种子细胞，利用转基因细胞持续高效表达高生物活性的内源性GF，调控种子细胞定向分化，有望很好地解决这一问题。 本研究中我们设计合成一种新型双功能RGD多肽-(K)16GRGDSPC，它既能通过整合素受体介导细胞特异性粘附，又能作为靶向性非病毒载体介导基因转染。通过本体化学改性的方法，将亲水性的PEG和具有生物活性基团的ASP同时引入PLGA分子链，制备新型三嵌段高分子骨基质材料PLGA-[ASP-PEG]。将RGD多肽GRGDSPC和(K)16GRGDSPC分别共价固定对PLGA-[ASP-PEG]表面修饰，赋予其生物学信号和细胞特异性识别位点，介导BMSCs特异性高效粘附。(K)16GRGDSPC表面修饰的高分子骨基质材料通过(K)16静电包裹外源TGF-1基因并介导基因在BMSCs内的高效转染和表达，研制出具有完全自主知识产权的载基因仿生骨基质材料。这种新型GAM具有三维多孔结构，能为细胞的生长增殖和分化提供良好的支撑；同时具有良好的表面活性，能特异性地介导BMSCs粘附；还具有良好的骨诱导活性，可通过原位介导TGF- 1基因转染与表达从而调控BMSCs成骨定向分化。研究发现，载基因仿生骨基质材料复合BMSCs构建组织工程化骨可显著提高骨缺损修复质量。 三、成果的创造性、先进性 本课题利用生物活性多肽对高分子骨基质材料表面修饰并将其应用于骨组织工程学领域的研究在国内外未见文献报道，具有明显创新性和先进性。表现为： 1、将聚乙二醇(PEG)和天冬氨酸(ASP)与PLGA共聚，合成聚(丙交酯-co-乙交酯)-天冬氨酸-聚乙二醇[PLGA-(ASP-PEG)n]三嵌段共聚物，制备PLGA-(ASP- PEG)多孔骨基质材料，其体内外生物相容性良好； 2、合成RGD肽GRGDSPC并将其共价接枝对高分子骨基质材料表面修饰，并将其应用于骨组织工程学领域，能显著促进骨组织工程种子细胞BMSCs粘附及分化； 3、设计合成一种具有双重功能的新型RGD肽(K)16GRGDSPC，该肽既能作为整合素受体的配体介导BMSCs高效粘附，又能作为靶向性非病毒载体介导基因转染，优化其介导外源TGF-β1基因转染BMSCs的各项最佳条件，并将其共价接枝对高分子骨基质材料表面修饰，显著促进BMSCs粘附、增殖及分化； 4、通过双功能多肽(K)16GRGDSPC对高分子骨基质材料表面修饰并与外源基因复合，构建一种新型基因活化基质，该基因活化基质不仅促进细胞粘附和功能表达，且介导基因转染的能力大大提高，显著改善传统基因活化基质将基因简单涂覆在基质材料表面导致转染效率低下的不足，为原位组织工程学提供了一种新技术； 5、将外源TGF-β1基因通过载基因仿生骨基质材料原位转入骨组织工程种子细胞BMSCs，并将BMSCs与载基因基质材料复合移植修复骨缺损，取得良好效果。 四、成果意义及推广应用前景 本研究中将RGD多肽GRGDSPC和(K)16GRGDSPC分别共价固定对高分子骨基质材料表面修饰，赋予其生物学信号和细胞特异性识别位点，介导BMSCs特异性高效粘附，为基质材料表面修饰基础理论研究提供了两种理想的生物信号分子。同时，(K)16GRGDSPC作为一种非病毒载体在转基因技术领域有广阔的应用前景。 本研究制备一种新型三嵌段高分子骨基质材料PLGA-[ASP-PEG]，并研制出载基因仿生骨基质材料，复合BMSCs构建组织工程化人工骨可显著提高骨缺损修复质量，为骨修复材料严重短缺这一问题的根本解决带来了可能。组织工程相关产品正逐步形成高附加值的高科技产业，市场潜力巨大。本项目可研制开发具有更好修复质量和良好生物学活性的系列组织工程化人工骨修复材料，创新性和竞争力强，临床适应证广，故具有极为广阔的临床应用前景。