一、简要技术说明： 　　（一）任务来源： 　　内蒙古自治区科技厅自然科学基金面上项目：“含CpG基序的寡核苷酸对抗原免疫小鼠佐剂效应的研究”，项目编号：200508010905，资助金额2万元。 　　（二）技术说明： 　　本项目主要应用人工合成含CpG基序的寡脱氧核苷酸(CpG ODN)与重组乙肝表面抗原(rHBsAg)联合免疫纯系小鼠，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)、流式细胞术(FACS)、免疫组织化学、淋巴细胞增殖试验（3H-TdR掺入法和MTT掺入法）等免疫学、细胞生物学、分子生物学等各学科领域先进的实验方法完成了免疫小鼠与对照组体液免疫应答指标的检测（包括血清IgG抗体及其亚类IgG2a/IgG1，抗体产生动力学观察）和特异性细胞介导的免疫应答指标的检测（包括Th1/Th2型细胞因子，脾脏和胸腺组织化学观察、淋巴细胞增殖、细胞周期与凋亡实验、NK细胞表面分子表达和杀伤功能等指标的检测）。项目立题新颖、设计科合理、技术路线思路清晰、工作量大、实验方法先进，所得大量数据和结果可信度高，结论正确，科研成果显著，达到国内先进水平。 　　（三）性能指标： 　　1.原计划完成指标： 　　（1）应用含CpG ODN的rHBsAg免疫小鼠，增强机体针对HBsAg的特异性抗体的产生，而且延长抗体滴度的持续时间。 　　（2）诱导免疫后的小鼠产生高水平的Th1型细胞因子（IL-2、IFN-γ、IL-12等）。 　　（3）增强NK细胞的非特异性细胞毒效应。 　　（4）发表1～2篇核心期刊科研论文。 　　2.实际完成指标： 　　（1）本项目主要探讨CPG ODN能否诱导强而有效的针对细胞内感染的病原微生物的Th1型免疫应答，经过检测，获得如下一系列有价值的实验结果： 　　①CpG ODN能够显著增强rHBsAg免疫小鼠产生高滴度的特异性抗体及抗体峰值维持时间。加CpG ODN实验组的抗体效价峰值高达1:51200，持续时间长达2～3周。而不加CpG ODN对照组，抗体峰值仅为1:25600。 　　②抗体亚类检测结果显示，CpG ODN明显提高抗-HBs IgG2a/IgG1比值。加CpG ODN实验组的抗-HBs IgG2a/IgG1比值为不加CpG ODN对照组的3倍。 　　③Th1/Th2型细胞因子检测结果表明，CpG ODN显著增加免疫细胞Th1型细胞因子（IL-2,IFN-γ和IL-12）的表达量。加CpG ODN实验组的实验结果与不加CpG ODN对照组相比，Th1型细胞因子的表达量明显增加，结果具有统计学意义，P＜0.01。 　　④加强免疫后2周的小鼠脾脏组织切片，经HE染色后，可见到加CpG ODN实验组的脾脏组织T细胞区淋巴细胞增殖活跃、生发中心增大等特征，而对照组脾脏则无明显改变。 　　⑤脾淋巴细胞增殖试验检测结果显示，加强免疫后2周，自发的或分别经ConA、rHBsAg诱导的淋巴细胞增殖试验，rHBsAg＋CpG ODN实验组的非特异性和特异性淋巴细胞增殖效应与不加CpG ODN的rHBsAg对照组相比，淋巴细胞增殖效应明显增高，结果具有统计学意义，P＜0.05。 　　⑥实验动物加强免疫后2周，经FACS分析结果显示，免疫小鼠脾脏NK细胞表面标志NK1.1在加CpG ODN实验组与不加CpG ODN对照组之间的表达情况没有显著的差异。 　　⑦加强免疫后2周，免疫小鼠脾脏NK细胞细胞毒活性检测结果表明，当效靶比为200:1时，CpG ODN＋rHBsAg组的杀伤率为12.193%；不加CpG ODN的rHBsAg对照组的杀伤率仅为3.028%。当效靶比为100:1时，CpG ODN＋rHBsAg组的杀伤率为2.438%；不加CpG ODN的rHBsAg对照组的杀伤率为0。 　　上述结果显示，CpG ODN＋rHBsAg组的靶细胞杀伤率明显高于不加CpG ODN对照组，差异具有统计学意义，P＜0.01。 　　上述实验结果表明：CpG ODN与蛋白质抗原联合应用，不仅能够增强机体体液免疫应答水平，同时具有明显诱导Th1型细胞免疫应答的佐剂效应。 　　（2）发表论文情况： 　　根据上述实验结果，撰写并公开发表核心期刊论文共计9篇，其中一篇获得优秀论文奖并应中国科协邀请，全文收录于2008年《中国科协英文论文集》；在学术会议论文集发表英文摘要一篇。 　　（3）培养硕士研究生： 　　课题组的两名硕士研究生通过基础理论的学习以及实验技能的培训，不仅掌握了相关领域的理论基础知识和娴熟的实验技能，同时培养了较强的科研思维能力，均能独立开展科研工作。两名硕士研究生先后毕业并获得了硕士学位，其中一名研究生现已考取了博士研究生，另一名研究生毕业论文获得了优秀论文奖并被用人单位在读期间提前录用为技术骨干，现已申请并获得内蒙古医学院“青年基金项目”一项。 　　（4）参加学术会议： 　　①2005年4月参加“The 3rd Congress of the Federation of Immunology Societies of Asia-Oceania”（第三届亚洲及太平洋免疫学术研讨大会，杭州）。并在会议论文集上发表英文摘要一篇。 　　②2005年8月参加东北三省及内蒙古自治区第二次微生物学术论文研讨会（呼和浩特），并在《中国生物制品学杂志》上发表论文2篇。 　　③2005年10月参加中国免疫学杂志第八次免疫学术论文研讨会（广东汕头），论文进行了大会交流并获优秀论文奖，论文在《中国免疫学杂志》上发表并应中国科协邀请，全文收录于2008年《中国科协英文论文集》。 　　④2006年6月27～29日：参加内蒙古自治区微生物学会学术研讨会暨换届选举大会，并在大会上做题为“The Effects of CpG ODN On Cell Cycle and Apoptosis of Splenocytes and Cytotoxicity of Cytotoxic T Lymphocytes in Mice Immunized with Recombinant HBsAg (rHBsAg) ”的报告。 　　（四）与国内外同类技术比较： 　　国内外对CpG ODN佐剂效应的研究也只是近十多年来的工作，取得了一些可喜的研究成果，但尚未成为获准可应用于人类疫苗的分子佐剂。本项目研究采用含CpG基序的人工合成寡脱氧核苷酸(CpG ODN)联合重组乙肝表面抗原(rHBsAg)免疫纯系小鼠，对其诱导实验动物的体液免疫应答和细胞免疫应答效应进行了系统的检测，探讨CpG ODN是否具有显著的佐剂效应，主要诱导什么类型的免疫应答以及是否与现有乙肝疫苗中的氢氧化铝佐剂是否具有协同效应等。通过大量的研究发现，CpG ODN具有显著的Th1型佐剂效应，可以诱导机体产生有效的特异性细胞介导的免疫应答，同时与现存乙肝疫苗中氢氧化铝佐剂具有协同效应。 　　（五）成果的创造性、先进性： 　　1.应用含CPG基序的小分子寡脱氧核苷酸作为免疫增强剂制备新型疫苗与常规乙肝疫苗的最大区别是，以CPG ODN作为免疫增强剂诱导机体产生的免疫应答类型是以产生以Th1型为主免疫应答。一方面可以借助特异性和非特异性杀伤细胞杀伤并清除侵入靶细胞内的病原微生物；另一方面，CPG ODN诱导Th1型细胞因子的产生，后者可以进一步增强机体的细胞介导的免疫功能和体液免疫功能，从而在预防和治疗细胞内的感染的病原微生物方面发挥有效的作用。 　　2.建立一种有效的特异性细胞毒性T细胞(CTL)的细胞毒活性检测方。为评价特异性细胞介导的免疫应答提供有效的检测手段。 　　二、应用前景： 　　本项目通过实验研究获得大量可靠的数据和结果，研究表明CpG ODN不仅能够增强蛋白类抗原诱导的体液免疫应答，而且能够显著诱导特异性细胞介导的免疫应答，具有明显的Th1型佐剂效应；此外，CpG ODN与现有乙肝疫苗中氢氧化铝佐剂具有明显的协同效应。同时，国内外研究结果表明，CpG ODN具有安全性高等一系列优点。因此，CpG ODN有望能够在新型疫苗研制中作为有效的分子佐剂，同时还可以用于对现有疫苗进行改进，增强现有疫苗的免疫效果，从而为许多感染性疾病的预防、控制及治疗提供新的思路与方法，保障人类的生命健康，必将取得良好的社会效益和经济效益。

　　一、简要技术说明： 　　（一）任务来源： 　　内蒙古自治区科技厅自然科学基金面上项目：“含CpG基序的寡核苷酸对抗原免疫小鼠佐剂效应的研究”，项目编号：200508010905，资助金额2万元。 　　（二）技术说明： 　　本项目主要应用人工合成含CpG基序的寡脱氧核苷酸(CpG ODN)与重组乙肝表面抗原(rHBsAg)联合免疫纯系小鼠，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)、流式细胞术(FACS)、免疫组织化学、淋巴细胞增殖试验（3H-TdR掺入法和MTT掺入法）等免疫学、细胞生物学、分子生物学等各学科领域先进的实验方法完成了免疫小鼠与对照组体液免疫应答指标的检测（包括血清IgG抗体及其亚类IgG2a/IgG1，抗体产生动力学观察）和特异性细胞介导的免疫应答指标的检测（包括Th1/Th2型细胞因子，脾脏和胸腺组织化学观察、淋巴细胞增殖、细胞周期与凋亡实验、NK细胞表面分子表达和杀伤功能等指标的检测）。项目立题新颖、设计科合理、技术路线思路清晰、工作量大、实验方法先进，所得大量数据和结果可信度高，结论正确，科研成果显著，达到国内先进水平。 　　（三）性能指标： 　　1.原计划完成指标： 　　（1）应用含CpG ODN的rHBsAg免疫小鼠，增强机体针对HBsAg的特异性抗体的产生，而且延长抗体滴度的持续时间。 　　（2）诱导免疫后的小鼠产生高水平的Th1型细胞因子（IL-2、IFN-γ、IL-12等）。 　　（3）增强NK细胞的非特异性细胞毒效应。 　　（4）发表1～2篇核心期刊科研论文。 　　2.实际完成指标： 　　（1）本项目主要探讨CPG ODN能否诱导强而有效的针对细胞内感染的病原微生物的Th1型免疫应答，经过检测，获得如下一系列有价值的实验结果： 　　①CpG ODN能够显著增强rHBsAg免疫小鼠产生高滴度的特异性抗体及抗体峰值维持时间。加CpG ODN实验组的抗体效价峰值高达1:51200，持续时间长达2～3周。而不加CpG ODN对照组，抗体峰值仅为1:25600。 　　②抗体亚类检测结果显示，CpG ODN明显提高抗-HBs IgG2a/IgG1比值。加CpG ODN实验组的抗-HBs IgG2a/IgG1比值为不加CpG ODN对照组的3倍。 　　③Th1/Th2型细胞因子检测结果表明，CpG ODN显著增加免疫细胞Th1型细胞因子（IL-2,IFN-γ和IL-12）的表达量。加CpG ODN实验组的实验结果与不加CpG ODN对照组相比，Th1型细胞因子的表达量明显增加，结果具有统计学意义，P＜0.01。 　　④加强免疫后2周的小鼠脾脏组织切片，经HE染色后，可见到加CpG ODN实验组的脾脏组织T细胞区淋巴细胞增殖活跃、生发中心增大等特征，而对照组脾脏则无明显改变。 　　⑤脾淋巴细胞增殖试验检测结果显示，加强免疫后2周，自发的或分别经ConA、rHBsAg诱导的淋巴细胞增殖试验，rHBsAg＋CpG ODN实验组的非特异性和特异性淋巴细胞增殖效应与不加CpG ODN的rHBsAg对照组相比，淋巴细胞增殖效应明显增高，结果具有统计学意义，P＜0.05。 　　⑥实验动物加强免疫后2周，经FACS分析结果显示，免疫小鼠脾脏NK细胞表面标志NK1.1在加CpG ODN实验组与不加CpG ODN对照组之间的表达情况没有显著的差异。 　　⑦加强免疫后2周，免疫小鼠脾脏NK细胞细胞毒活性检测结果表明，当效靶比为200:1时，CpG ODN＋rHBsAg组的杀伤率为12.193%；不加CpG ODN的rHBsAg对照组的杀伤率仅为3.028%。当效靶比为100:1时，CpG ODN＋rHBsAg组的杀伤率为2.438%；不加CpG ODN的rHBsAg对照组的杀伤率为0。 　　上述结果显示，CpG ODN＋rHBsAg组的靶细胞杀伤率明显高于不加CpG ODN对照组，差异具有统计学意义，P＜0.01。 　　上述实验结果表明：CpG ODN与蛋白质抗原联合应用，不仅能够增强机体体液免疫应答水平，同时具有明显诱导Th1型细胞免疫应答的佐剂效应。 　　（2）发表论文情况： 　　根据上述实验结果，撰写并公开发表核心期刊论文共计9篇，其中一篇获得优秀论文奖并应中国科协邀请，全文收录于2008年《中国科协英文论文集》；在学术会议论文集发表英文摘要一篇。 　　（3）培养硕士研究生： 　　课题组的两名硕士研究生通过基础理论的学习以及实验技能的培训，不仅掌握了相关领域的理论基础知识和娴熟的实验技能，同时培养了较强的科研思维能力，均能独立开展科研工作。两名硕士研究生先后毕业并获得了硕士学位，其中一名研究生现已考取了博士研究生，另一名研究生毕业论文获得了优秀论文奖并被用人单位在读期间提前录用为技术骨干，现已申请并获得内蒙古医学院“青年基金项目”一项。 　　（4）参加学术会议： 　　①2005年4月参加“The 3rd Congress of the Federation of Immunology Societies of Asia-Oceania”（第三届亚洲及太平洋免疫学术研讨大会，杭州）。并在会议论文集上发表英文摘要一篇。 　　②2005年8月参加东北三省及内蒙古自治区第二次微生物学术论文研讨会（呼和浩特），并在《中国生物制品学杂志》上发表论文2篇。 　　③2005年10月参加中国免疫学杂志第八次免疫学术论文研讨会（广东汕头），论文进行了大会交流并获优秀论文奖，论文在《中国免疫学杂志》上发表并应中国科协邀请，全文收录于2008年《中国科协英文论文集》。 　　④2006年6月27～29日：参加内蒙古自治区微生物学会学术研讨会暨换届选举大会，并在大会上做题为“The Effects of CpG ODN On Cell Cycle and Apoptosis of Splenocytes and Cytotoxicity of Cytotoxic T Lymphocytes in Mice Immunized with Recombinant HBsAg (rHBsAg) ”的报告。 　　（四）与国内外同类技术比较： 　　国内外对CpG ODN佐剂效应的研究也只是近十多年来的工作，取得了一些可喜的研究成果，但尚未成为获准可应用于人类疫苗的分子佐剂。本项目研究采用含CpG基序的人工合成寡脱氧核苷酸(CpG ODN)联合重组乙肝表面抗原(rHBsAg)免疫纯系小鼠，对其诱导实验动物的体液免疫应答和细胞免疫应答效应进行了系统的检测，探讨CpG ODN是否具有显著的佐剂效应，主要诱导什么类型的免疫应答以及是否与现有乙肝疫苗中的氢氧化铝佐剂是否具有协同效应等。通过大量的研究发现，CpG ODN具有显著的Th1型佐剂效应，可以诱导机体产生有效的特异性细胞介导的免疫应答，同时与现存乙肝疫苗中氢氧化铝佐剂具有协同效应。 　　（五）成果的创造性、先进性： 　　1.应用含CPG基序的小分子寡脱氧核苷酸作为免疫增强剂制备新型疫苗与常规乙肝疫苗的最大区别是，以CPG ODN作为免疫增强剂诱导机体产生的免疫应答类型是以产生以Th1型为主免疫应答。一方面可以借助特异性和非特异性杀伤细胞杀伤并清除侵入靶细胞内的病原微生物；另一方面，CPG ODN诱导Th1型细胞因子的产生，后者可以进一步增强机体的细胞介导的免疫功能和体液免疫功能，从而在预防和治疗细胞内的感染的病原微生物方面发挥有效的作用。 　　2.建立一种有效的特异性细胞毒性T细胞(CTL)的细胞毒活性检测方。为评价特异性细胞介导的免疫应答提供有效的检测手段。 　　二、应用前景： 　　本项目通过实验研究获得大量可靠的数据和结果，研究表明CpG ODN不仅能够增强蛋白类抗原诱导的体液免疫应答，而且能够显著诱导特异性细胞介导的免疫应答，具有明显的Th1型佐剂效应；此外，CpG ODN与现有乙肝疫苗中氢氧化铝佐剂具有明显的协同效应。同时，国内外研究结果表明，CpG ODN具有安全性高等一系列优点。因此，CpG ODN有望能够在新型疫苗研制中作为有效的分子佐剂，同时还可以用于对现有疫苗进行改进，增强现有疫苗的免疫效果，从而为许多感染性疾病的预防、控制及治疗提供新的思路与方法，保障人类的生命健康，必将取得良好的社会效益和经济效益。