（1）任务来源：本课题为甘肃省科学事业费项目，项目编号为QS05-C33-18 。 　　（2）应用领域和技术原理:亚甲基四氢叶酸还原酶（N5,10-methylenetetrahydrofolate reductase ，MTHFR）是转甲基通路上一种酶，其功能是催化生成甲基四氢叶酸，是血同型半胱氨酸（Hcy）的一碳供者，使Hcy转变为蛋氨酸。若MTHFR发生突变，则会使Hcy增高。同时若饮食中叶酸和维生素B12缺乏也会导致Hcy水平升高。而高HCY血症是公认的心、脑血管危险因素，但其与糖尿病微血管并发症关系研究较少并结论不一。 　　本课题以甘肃汉族2型糖尿病(T2DM)及并发糖尿病肾病(DN)的患者和正常对照人群为研究对象，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）的方法检测不同组MTHFR基因型及频率的分布，探讨T2DM和DN的易感基因分布情况 。我国北方地区缺乏新鲜的蔬菜、水果，尤其是冬季，饮食习惯喜食熟食和腌制食品，叶酸和维生素B12很容易缺乏，用放射免疫法检测DN各组的叶酸和维生素B12水平，探讨甘肃地区叶酸、维生素B12缺乏程度与DN发病及病情轻重之间的关系，中重度DN一旦发生便不可逆转，期望从饮食及代谢方面寻求对DN的早期经济、有效防治措施。 　　本课题为进一步从饮食因素和遗传因素阻断高Hcy血症，减少其对糖尿病肾病（DN）的影响奠定了一定的理论基础，为早期防治DN新型药物的开发如经济、有效的叶酸、B组维生素及Hcy受体和运载蛋白的拮抗剂和/或阻断剂防治高Hcy血症可提供理论依据。 　　（3）本课题涉及性能指标： MTHFR基因型及基因频率分布，具体步骤有①糖尿病患者外周血基因组DNA的提取；②MTHFR基因片断的扩增，PCR；③HinfⅠ酶切PCR产物；④电泳分析、UVP凝聚成像系统中观察，分析基因型；⑤计算基因频率的分布。完成了合同要求的主要性能，用分子生物学方法筛查了甘肃汉族T2DM及DN易感人群，DN患者MTHFR基因突变导致T等位基因频率达59 .8%，与正常对照C组（27.1%）和DM组（40%）频率分布差异有显著意义。T等位基因与DN的发生明显相关。同时用放射免疫法检测血清叶酸、维生素B12水平。观察到DN组正常白蛋白尿（NAU）组，微量白蛋白尿（MAU）组，临床白蛋白尿组（CAU）。微量白蛋白尿（MAU）组和临床白蛋白尿组（CAU）组尿微量白蛋白排泄率（UAER）显著高于正常对照（NC组）。2型糖尿病各组患者血清叶酸水平显著低于NC组（P ＜0.01）,维生素B12水平亦低于NC组（P ＜0.05），叶酸和维生素B12水平在NAU组和MAU组间有显著差异（P ＜0.01），随UAER的增高，血叶酸和维生素B12水平下降。UAER与叶酸维生素B12呈负相关。结论完成了合同要求的主要性能指标，对叶酸、维生素B12和DN的关系进行了初步探讨。另一性能指标同型半胱氨酸（（Hcy）因测定试剂和方法较昂贵，未同时测定，期望以后进一步观察研究。同时可结合目前研究结论对经济、有效的叶酸、B组维生素及Hcy受体和运载蛋白的拮抗剂和/或阻断剂防治高Hcy血症和早期防治DN药物进行研发。 （4）微量白蛋白尿组（MAU）组和临床白蛋白尿（CAU）组UAER显著高于NC组。2型糖尿病各组患者血清叶酸水平及维生素B12水平显著低于NC组,叶酸和维生素B12水平在NAU组和MAU组间有显著差异，血清叶酸和维生素B12与UAER呈负相关。Hasegawa等研究了DM并发终末期肾病（EASD）时MTHFR基因和血Hcy水平和DN的关系，EASD一旦发生不可逆转和危害巨大，故本课题针对T2DM并发早期DN人群联合研究MTHFR基因和叶酸、维生素B12对早期有效防治DN具有更重要的意义。国内外未见此类报道。 （5）成果的创造性、先进性：本课题以中国西部甘肃汉族2型糖尿病患者为研究对象，采用分子生物学研究中先进的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）的方法检测不同组MTHFR基因型，创造性的将扩增产物和酶切产物对比电泳，探索了一种实验新方法，与文献报道其他方法相比节约了成本，提高了电泳产物的准确性，观察分析到MTHFR基因C677T多态性与2型糖尿病及DN的相互关系。同时检测叶酸、维生素B12水平，从营养及遗传两方面研究与DN的关系，国内外尚未见报道。甘肃地区叶酸、维生素B12缺乏与DN发病及病情轻重之间有关。随UAER的增高，血清叶酸、维生素B12水平进行性下降，推测叶酸、维生素B12水平可间接反映糖尿病肾病（DN）的病情轻重。糖尿病肾病早期补充叶酸、维生素B12可能是延缓DN进展的新的经济、有效的方法。本课题探索了早期预防和早期治疗DN的新观点，具有一定的先进性。 （6）作用意义：临床工作中发现，有些血糖长期控制不良的患者并不出现DN，而部分患者即使严格控制血糖却在短期内发生DN，说明遗传因素及DM异质性起着关键的作用。DN易感基因的寻找及针对不同遗传模式的基因采取不同的策略是当前DN分子遗传学研究的重要领域。本课题研究发现结果更加证明了这一点。同时大量研究表明，环境因素对DN的发生发展中也起着关键作用。中重度DN一旦发生便不可逆转，给患者及社会带来巨大的经济负担，本课题探讨并试图寻求新的经济、有效的方法期望从饮食及代谢方面寻求对DN的早期预防及治疗，具有一定的社会意义和经济效益。

　　（1）任务来源：本课题为甘肃省科学事业费项目，项目编号为QS05-C33-18 。 　　（2）应用领域和技术原理:亚甲基四氢叶酸还原酶（N5,10-methylenetetrahydrofolate reductase ，MTHFR）是转甲基通路上一种酶，其功能是催化生成甲基四氢叶酸，是血同型半胱氨酸（Hcy）的一碳供者，使Hcy转变为蛋氨酸。若MTHFR发生突变，则会使Hcy增高。同时若饮食中叶酸和维生素B12缺乏也会导致Hcy水平升高。而高HCY血症是公认的心、脑血管危险因素，但其与糖尿病微血管并发症关系研究较少并结论不一。 　　本课题以甘肃汉族2型糖尿病(T2DM)及并发糖尿病肾病(DN)的患者和正常对照人群为研究对象，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）的方法检测不同组MTHFR基因型及频率的分布，探讨T2DM和DN的易感基因分布情况 。我国北方地区缺乏新鲜的蔬菜、水果，尤其是冬季，饮食习惯喜食熟食和腌制食品，叶酸和维生素B12很容易缺乏，用放射免疫法检测DN各组的叶酸和维生素B12水平，探讨甘肃地区叶酸、维生素B12缺乏程度与DN发病及病情轻重之间的关系，中重度DN一旦发生便不可逆转，期望从饮食及代谢方面寻求对DN的早期经济、有效防治措施。 　　本课题为进一步从饮食因素和遗传因素阻断高Hcy血症，减少其对糖尿病肾病（DN）的影响奠定了一定的理论基础，为早期防治DN新型药物的开发如经济、有效的叶酸、B组维生素及Hcy受体和运载蛋白的拮抗剂和/或阻断剂防治高Hcy血症可提供理论依据。 　　（3）本课题涉及性能指标： MTHFR基因型及基因频率分布，具体步骤有①糖尿病患者外周血基因组DNA的提取；②MTHFR基因片断的扩增，PCR；③HinfⅠ酶切PCR产物；④电泳分析、UVP凝聚成像系统中观察，分析基因型；⑤计算基因频率的分布。完成了合同要求的主要性能，用分子生物学方法筛查了甘肃汉族T2DM及DN易感人群，DN患者MTHFR基因突变导致T等位基因频率达59 .8%，与正常对照C组（27.1%）和DM组（40%）频率分布差异有显著意义。T等位基因与DN的发生明显相关。同时用放射免疫法检测血清叶酸、维生素B12水平。观察到DN组正常白蛋白尿（NAU）组，微量白蛋白尿（MAU）组，临床白蛋白尿组（CAU）。微量白蛋白尿（MAU）组和临床白蛋白尿组（CAU）组尿微量白蛋白排泄率（UAER）显著高于正常对照（NC组）。2型糖尿病各组患者血清叶酸水平显著低于NC组（P ＜0.01）,维生素B12水平亦低于NC组（P ＜0.05），叶酸和维生素B12水平在NAU组和MAU组间有显著差异（P ＜0.01），随UAER的增高，血叶酸和维生素B12水平下降。UAER与叶酸维生素B12呈负相关。结论完成了合同要求的主要性能指标，对叶酸、维生素B12和DN的关系进行了初步探讨。另一性能指标同型半胱氨酸（（Hcy）因测定试剂和方法较昂贵，未同时测定，期望以后进一步观察研究。同时可结合目前研究结论对经济、有效的叶酸、B组维生素及Hcy受体和运载蛋白的拮抗剂和/或阻断剂防治高Hcy血症和早期防治DN药物进行研发。 （4）微量白蛋白尿组（MAU）组和临床白蛋白尿（CAU）组UAER显著高于NC组。2型糖尿病各组患者血清叶酸水平及维生素B12水平显著低于NC组,叶酸和维生素B12水平在NAU组和MAU组间有显著差异，血清叶酸和维生素B12与UAER呈负相关。Hasegawa等研究了DM并发终末期肾病（EASD）时MTHFR基因和血Hcy水平和DN的关系，EASD一旦发生不可逆转和危害巨大，故本课题针对T2DM并发早期DN人群联合研究MTHFR基因和叶酸、维生素B12对早期有效防治DN具有更重要的意义。国内外未见此类报道。 （5）成果的创造性、先进性：本课题以中国西部甘肃汉族2型糖尿病患者为研究对象，采用分子生物学研究中先进的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）的方法检测不同组MTHFR基因型，创造性的将扩增产物和酶切产物对比电泳，探索了一种实验新方法，与文献报道其他方法相比节约了成本，提高了电泳产物的准确性，观察分析到MTHFR基因C677T多态性与2型糖尿病及DN的相互关系。同时检测叶酸、维生素B12水平，从营养及遗传两方面研究与DN的关系，国内外尚未见报道。甘肃地区叶酸、维生素B12缺乏与DN发病及病情轻重之间有关。随UAER的增高，血清叶酸、维生素B12水平进行性下降，推测叶酸、维生素B12水平可间接反映糖尿病肾病（DN）的病情轻重。糖尿病肾病早期补充叶酸、维生素B12可能是延缓DN进展的新的经济、有效的方法。本课题探索了早期预防和早期治疗DN的新观点，具有一定的先进性。 （6）作用意义：临床工作中发现，有些血糖长期控制不良的患者并不出现DN，而部分患者即使严格控制血糖却在短期内发生DN，说明遗传因素及DM异质性起着关键的作用。DN易感基因的寻找及针对不同遗传模式的基因采取不同的策略是当前DN分子遗传学研究的重要领域。本课题研究发现结果更加证明了这一点。同时大量研究表明，环境因素对DN的发生发展中也起着关键作用。中重度DN一旦发生便不可逆转，给患者及社会带来巨大的经济负担，本课题探讨并试图寻求新的经济、有效的方法期望从饮食及代谢方面寻求对DN的早期预防及治疗，具有一定的社会意义和经济效益。