本实验从新生大鼠大脑中分离出海马组织，通过无血清悬浮培养法获得神经干细胞，在基础培养液中加入脑源性神经营养因子(BDNF)，观察其对神经干细胞向神经元定向分化的影响，为将来BDNF作为神经干细胞诱导剂诱导体内神经干细胞，以及调控移植后的异体神经干细胞分化为神经元治疗脑损伤性疾病提供实验依据及理论基础。 主要技术指标： 1.取材及神经干细胞原代、传代培养 无菌条件下常规分离新生24h龄Wistar大鼠的海马组织，Hank，s液漂洗3遍后，剪成糊状，加入DMEM(Dulbecco modified Eagle medium，Dulbecco改进的Eagle培养基)培养液，用抛光的长颈吸管反复吹打成单细胞悬液，用200目过滤网过滤，台盼蓝染色计数后，以5×105个/mL的密度接种于50mL培养瓶中，加入DMEM完全培养液(DMEM，B27 20mg/mL，bFGF 20μg/L，EGF 20μg/L)，调整细胞密度为2×106/mL后接种于培养瓶。放入37℃，5％CO2的饱和湿度培养箱中培养。每d在显微镜下观察细胞生长情况，每隔3d换1次液。约7d～10d后传代培养。 2.NSCs的鉴定 将涂有多聚赖氨酸的无菌载玻片放入六孔培养板的底部，取传2代的神经细胞加入其中，按上述条件继续培养24h，进行免疫荧光鉴定。40mg/mL多聚甲醛固定30min，PBS漂洗3次，3mg/mL的过氧化氢封闭30min，滴加山羊血清封闭液，室温20min，甩掉血清后滴加一抗（nestin 1：400），4℃过夜。PBS洗3次，滴加FITC标记的荧光二抗（1：100），常温避光孵育40min，PBS漂洗，荧光显微镜下观察。 3.实验分组及NSCs的分化培养 将NSCs分为实验组和对照组，每组15个样本。实验组含诱导分化剂：50g/L胎牛血清和20μg/L BDNF；对照组含50g/L胎牛血清。两组基础培养基均为DMEM+B27 20g/L。将传三代的神经干细胞加入到六孔培养板中，每孔的细胞数均为1×105个，分别加入不同的诱导剂，按上述条件继续培养，2d～3d换液一次，1w后做鉴。 4.NSCs诱导分化结果的检测 用免疫细胞化学法检测分化细胞。一抗为兔抗-NSE（1：400），二抗为羊抗（1：200），SABC显色，倒置显微镜下观察。 5.流式细胞仪检测诱导分化后NSE阳性神经元比例 将细胞收集在一个离心管内混匀，1000转/min离心10min，去上清，滴加破膜剂中的Reagent A，避光15min，漂洗，1000转/min离心10min，去上清，滴加Reagent B，同时滴加NSE（1：200），避光20min，漂洗，1000转/min离心10min，加入FITC标记的二抗（1：100），常温避光20min，漂洗，含1％多聚甲醛的PBS重悬细胞，上机检测，记数阳性细胞数。 6.统计学分析 采用SPSS11.0软件分析，结果以x±s，流式细胞仪检测到的NSE阳性神经元占总数的比率作x2检验，P＜0.005表示差异有统计学意义。 结论： （1）从新生大鼠的海马组织中能培养出神经干细胞。 （2）脑源性神经营养因子能诱导海马神经干细胞向神经细胞方向分化。 （3）脑源性神经营养因子能显著提高海马神经干细胞向神经元方向分化的比例。 生长因子在神经干细胞的增殖、分化和存活过程中有重要作用。已有观察脑源性神经营养因子（BDNF）对神经干细胞（NSCs）定向分化的影响以及探索NSCs分化机制的研究，已有研究认为BDNF能促进NSCs增殖和存活，并指出BDNF可促进NSCs向神经元定向分化，也有研究指出BDNF能诱导海马NSCs向神经细胞方向分化，但均未明确提出BDN能显著提高海马NSCs向神经元方向分化的比例。通过动物实验观察BDNF对NSCs定向分化的影响，揭示BDNF能显著提高NSCs定向分化的比例，旨在为将来BDNF作为NSCs诱导剂诱导体内NSCs，以及调控移植后的异体NSCs分化为神经元治疗脑损伤性疾病提供实验依据及理论基础。 可应用于缺氧缺血性脑损伤动物模型对损伤脑组织的治疗作用，以便于将来尽早应用于临床，为其提供实验性理论依据。 我们的措施有： 1、发表论文，与同道交流。 2、参加学术会议交流。 3、可进一步研究BDNF对脑内神经干细胞及对移植神经干细胞的影响。

本实验从新生大鼠大脑中分离出海马组织，通过无血清悬浮培养法获得神经干细胞，在基础培养液中加入脑源性神经营养因子(BDNF)，观察其对神经干细胞向神经元定向分化的影响，为将来BDNF作为神经干细胞诱导剂诱导体内神经干细胞，以及调控移植后的异体神经干细胞分化为神经元治疗脑损伤性疾病提供实验依据及理论基础。 主要技术指标： 1.取材及神经干细胞原代、传代培养 无菌条件下常规分离新生24h龄Wistar大鼠的海马组织，Hank，s液漂洗3遍后，剪成糊状，加入DMEM(Dulbecco modified Eagle medium，Dulbecco改进的Eagle培养基)培养液，用抛光的长颈吸管反复吹打成单细胞悬液，用200目过滤网过滤，台盼蓝染色计数后，以5×105个/mL的密度接种于50mL培养瓶中，加入DMEM完全培养液(DMEM，B27 20mg/mL，bFGF 20μg/L，EGF 20μg/L)，调整细胞密度为2×106/mL后接种于培养瓶。放入37℃，5％CO2的饱和湿度培养箱中培养。每d在显微镜下观察细胞生长情况，每隔3d换1次液。约7d～10d后传代培养。 2.NSCs的鉴定 将涂有多聚赖氨酸的无菌载玻片放入六孔培养板的底部，取传2代的神经细胞加入其中，按上述条件继续培养24h，进行免疫荧光鉴定。40mg/mL多聚甲醛固定30min，PBS漂洗3次，3mg/mL的过氧化氢封闭30min，滴加山羊血清封闭液，室温20min，甩掉血清后滴加一抗（nestin 1：400），4℃过夜。PBS洗3次，滴加FITC标记的荧光二抗（1：100），常温避光孵育40min，PBS漂洗，荧光显微镜下观察。 3.实验分组及NSCs的分化培养 将NSCs分为实验组和对照组，每组15个样本。实验组含诱导分化剂：50g/L胎牛血清和20μg/L BDNF；对照组含50g/L胎牛血清。两组基础培养基均为DMEM+B27 20g/L。将传三代的神经干细胞加入到六孔培养板中，每孔的细胞数均为1×105个，分别加入不同的诱导剂，按上述条件继续培养，2d～3d换液一次，1w后做鉴。 4.NSCs诱导分化结果的检测 用免疫细胞化学法检测分化细胞。一抗为兔抗-NSE（1：400），二抗为羊抗（1：200），SABC显色，倒置显微镜下观察。 5.流式细胞仪检测诱导分化后NSE阳性神经元比例 将细胞收集在一个离心管内混匀，1000转/min离心10min，去上清，滴加破膜剂中的Reagent A，避光15min，漂洗，1000转/min离心10min，去上清，滴加Reagent B，同时滴加NSE（1：200），避光20min，漂洗，1000转/min离心10min，加入FITC标记的二抗（1：100），常温避光20min，漂洗，含1％多聚甲醛的PBS重悬细胞，上机检测，记数阳性细胞数。 6.统计学分析 采用SPSS11.0软件分析，结果以x±s，流式细胞仪检测到的NSE阳性神经元占总数的比率作x2检验，P＜0.005表示差异有统计学意义。 结论： （1）从新生大鼠的海马组织中能培养出神经干细胞。 （2）脑源性神经营养因子能诱导海马神经干细胞向神经细胞方向分化。 （3）脑源性神经营养因子能显著提高海马神经干细胞向神经元方向分化的比例。 生长因子在神经干细胞的增殖、分化和存活过程中有重要作用。已有观察脑源性神经营养因子（BDNF）对神经干细胞（NSCs）定向分化的影响以及探索NSCs分化机制的研究，已有研究认为BDNF能促进NSCs增殖和存活，并指出BDNF可促进NSCs向神经元定向分化，也有研究指出BDNF能诱导海马NSCs向神经细胞方向分化，但均未明确提出BDN能显著提高海马NSCs向神经元方向分化的比例。通过动物实验观察BDNF对NSCs定向分化的影响，揭示BDNF能显著提高NSCs定向分化的比例，旨在为将来BDNF作为NSCs诱导剂诱导体内NSCs，以及调控移植后的异体NSCs分化为神经元治疗脑损伤性疾病提供实验依据及理论基础。 可应用于缺氧缺血性脑损伤动物模型对损伤脑组织的治疗作用，以便于将来尽早应用于临床，为其提供实验性理论依据。 我们的措施有： 1、发表论文，与同道交流。 2、参加学术会议交流。 3、可进一步研究BDNF对脑内神经干细胞及对移植神经干细胞的影响。