一、课题来源与背景 　　在我国肠道致病菌污染食品而引起的食物中毒以及疾病散发也是直接造成人体健康损害的主要食源性危害之一。目前，我国尚没有建立起完善的食源性疾病报告系统。因此，在我国肠道致病性微生物引起的食源性疾病仍然是对健康的严重威胁。造成上述问题主要有三方面的原因：①检测上述致病菌的常规细菌培养方法耗时长、操作烦琐。②还没有建立快速准确对肠道致病菌进行检测的方法。③仍无有效、经济的高通量平行检测多种肠道病原菌的技术。 　　本课题研究拟采用基因芯片技术，结合导流杂交技术对8种肠道病原菌进行高通量检测；采用TaqMan探针技术的荧光聚合酶链反应鉴定肠道致病菌，为建立肠道传染病预警系统提供方法学依据。本项目的实施对感染肠道致病菌患者的早发现、早隔离、早治疗具有重要意义，不仅节约了国家的经济资源而且具有重要的社会意义。 　　二、技术原理及性能指标 　　根据靶细菌16S rDNA和23S rDNA的设计通用引物，反向引物5|端标记生物素；特异寡核苷酸探针设计在每种病原菌基因组两对引物之间的可变区，在5|端标记氨基基团。将探针点样于固相载体制备基因芯片，PCR产物与芯片进行导流杂交后化学显色观察结果。以金黄色葡萄球菌femB基因为靶序列，根据TaqMan探针技术荧光定量PCR原理设计并合成引物和荧光探针，对金黄色葡萄球菌进行实时荧光PCR检测。 　　1、通过筛选多种肠道致病菌寡核苷酸检测探针，优化PCR和杂交反应条件和时间等因素，建立基因芯片检测多种肠道致病菌的高通量方法。 　　2、将基因芯片与导流杂交技术相结合，建立快速、准确对多种临床致病菌检测的技术。 　　3、利用荧光定量PCR方法，建立检测金黄色葡萄球菌的方法。 　　三、技术的创造性与先进性 　　本研究通过比对分析16S rDNA、23S rDNA的保守区域，设计通用引物，并利用双重PCR使得实验操作简便，检测大量目的菌株。在保守区域之间的序列可变区设计各种靶细菌特异性的探针，使探针具有较高特异性的同时，大大地提高了实验的效率。寡核苷酸芯片的建立为导流杂交芯片技术提供了强有力的技术支持。 　　本研究将基因芯片与导流杂交技术结合，使杂交时间缩短至15分钟，远远少于传统杂交方法，使基因芯片高通量快速检测肠道致病菌成为可能。该方法的建立为临床病原菌的检测和诊断提供一种新思路，为快速、准确对多种临床病原菌进行鉴定搭建可靠的分子生物学技术平台。 　　四、技术的成熟程度、适用范围和安全性 　　应用该方法能准确检测八种肠道致病菌标准菌株，并与传统培养方法对120例腹泻患者粪便标本进行了比较，结果采用导流杂交芯片共检出68例(56.67%)携带肠道致病菌；细菌培养鉴定出63例(52.50%)携带肠道致病菌；其中58例导流杂交芯片与细菌培养结果一致，准确率为(85.29%)。而且该方法不同于其它基因芯片技术，它不仅适用于医院、疾控中心应用于临床诊断和流行病学调查，而且由于不需要扫描仪等特殊判读结果的仪器设备，肉眼便可以观察结果，因此该技术方法同样适用于基层医院的检测。 　　五、应用情况及存在的问题 　　每年有大量的食源性腹泻患者就诊，医院需要有快速诊断的方法对患者进行及早诊断与治疗。另外省市及各地区的疾病控制中心对肠道传染病进行监测，也需要快速简便的检测方法。因此本研究建立的多种肠道致病菌导流杂交芯片技术和金黄色葡萄球菌荧光定量PCR技术具有广阔的应用前景，是一种有推广应用价值的新技术、新方法。 　　1、本课题建立的导流杂交基因芯片检测临床常见多种致病菌的方法，可同时检测8种致病菌，由于使用的是细菌的通用引物，针对于基因芯片高通量的特点，目前检测的靶细菌种类较少。因此，在目前研究的基础上，应该进一步增加平行检测致病菌的种类，扩充基因芯片检测能力。 　　2、本课题建立的导流杂交基因芯片检测的靶致病菌均是检测细菌的核糖体基因，并未对细菌菌体内携带的毒素基因进行甄别。因此，可以在目前的芯片上增加毒素基因检测，进一步增加平行检测获得的结果信息，使得该导流杂交基因芯片系统得到的结果更完整，更全面。 　　六、历年获奖情况 　　该研究刚通过验收。

　　一、课题来源与背景 　　在我国肠道致病菌污染食品而引起的食物中毒以及疾病散发也是直接造成人体健康损害的主要食源性危害之一。目前，我国尚没有建立起完善的食源性疾病报告系统。因此，在我国肠道致病性微生物引起的食源性疾病仍然是对健康的严重威胁。造成上述问题主要有三方面的原因：①检测上述致病菌的常规细菌培养方法耗时长、操作烦琐。②还没有建立快速准确对肠道致病菌进行检测的方法。③仍无有效、经济的高通量平行检测多种肠道病原菌的技术。 　　本课题研究拟采用基因芯片技术，结合导流杂交技术对8种肠道病原菌进行高通量检测；采用TaqMan探针技术的荧光聚合酶链反应鉴定肠道致病菌，为建立肠道传染病预警系统提供方法学依据。本项目的实施对感染肠道致病菌患者的早发现、早隔离、早治疗具有重要意义，不仅节约了国家的经济资源而且具有重要的社会意义。 　　二、技术原理及性能指标 　　根据靶细菌16S rDNA和23S rDNA的设计通用引物，反向引物5|端标记生物素；特异寡核苷酸探针设计在每种病原菌基因组两对引物之间的可变区，在5|端标记氨基基团。将探针点样于固相载体制备基因芯片，PCR产物与芯片进行导流杂交后化学显色观察结果。以金黄色葡萄球菌femB基因为靶序列，根据TaqMan探针技术荧光定量PCR原理设计并合成引物和荧光探针，对金黄色葡萄球菌进行实时荧光PCR检测。 　　1、通过筛选多种肠道致病菌寡核苷酸检测探针，优化PCR和杂交反应条件和时间等因素，建立基因芯片检测多种肠道致病菌的高通量方法。 　　2、将基因芯片与导流杂交技术相结合，建立快速、准确对多种临床致病菌检测的技术。 　　3、利用荧光定量PCR方法，建立检测金黄色葡萄球菌的方法。 　　三、技术的创造性与先进性 　　本研究通过比对分析16S rDNA、23S rDNA的保守区域，设计通用引物，并利用双重PCR使得实验操作简便，检测大量目的菌株。在保守区域之间的序列可变区设计各种靶细菌特异性的探针，使探针具有较高特异性的同时，大大地提高了实验的效率。寡核苷酸芯片的建立为导流杂交芯片技术提供了强有力的技术支持。 　　本研究将基因芯片与导流杂交技术结合，使杂交时间缩短至15分钟，远远少于传统杂交方法，使基因芯片高通量快速检测肠道致病菌成为可能。该方法的建立为临床病原菌的检测和诊断提供一种新思路，为快速、准确对多种临床病原菌进行鉴定搭建可靠的分子生物学技术平台。 　　四、技术的成熟程度、适用范围和安全性 　　应用该方法能准确检测八种肠道致病菌标准菌株，并与传统培养方法对120例腹泻患者粪便标本进行了比较，结果采用导流杂交芯片共检出68例(56.67%)携带肠道致病菌；细菌培养鉴定出63例(52.50%)携带肠道致病菌；其中58例导流杂交芯片与细菌培养结果一致，准确率为(85.29%)。而且该方法不同于其它基因芯片技术，它不仅适用于医院、疾控中心应用于临床诊断和流行病学调查，而且由于不需要扫描仪等特殊判读结果的仪器设备，肉眼便可以观察结果，因此该技术方法同样适用于基层医院的检测。 　　五、应用情况及存在的问题 　　每年有大量的食源性腹泻患者就诊，医院需要有快速诊断的方法对患者进行及早诊断与治疗。另外省市及各地区的疾病控制中心对肠道传染病进行监测，也需要快速简便的检测方法。因此本研究建立的多种肠道致病菌导流杂交芯片技术和金黄色葡萄球菌荧光定量PCR技术具有广阔的应用前景，是一种有推广应用价值的新技术、新方法。 　　1、本课题建立的导流杂交基因芯片检测临床常见多种致病菌的方法，可同时检测8种致病菌，由于使用的是细菌的通用引物，针对于基因芯片高通量的特点，目前检测的靶细菌种类较少。因此，在目前研究的基础上，应该进一步增加平行检测致病菌的种类，扩充基因芯片检测能力。 　　2、本课题建立的导流杂交基因芯片检测的靶致病菌均是检测细菌的核糖体基因，并未对细菌菌体内携带的毒素基因进行甄别。因此，可以在目前的芯片上增加毒素基因检测，进一步增加平行检测获得的结果信息，使得该导流杂交基因芯片系统得到的结果更完整，更全面。 　　六、历年获奖情况 　　该研究刚通过验收。