一、课题来源、项目编号和经费数额： 　　本课题来源于吉林省卫生厅重点实验室招标项目（2006年6月28日批准），项目编号为017，共获得资助金额1万元。 　　二、立题目的、意义及必要性： 　　人类疱疹病毒6型(human herpesvirus 6， HHV-6)首次分离于AIDS及淋巴细胞增殖紊乱的患者，有A、B(HHV-6A、HHV-6B)两个亚型。国内外研究表明HHV-6B与儿童重症肝炎、成人的疲劳综合症、多发性硬化症等多项疾病有关。该病毒为包膜病毒，对淋巴细胞有亲嗜性，进入细胞时靠病毒包膜糖蛋白与易感细胞表面受体结合。研究表明哺乳类等细胞的膜蛋白主要集中于细胞膜上富含鞘磷脂和胆固醇的脂质微区，以复合物形式发挥功能，这些脂质微区称之为脂筏（lipid raft）。脂筏类似蛋白质停泊的平台，与膜的信号传导、蛋白质分选均有密切的关系。病毒吸附细胞后，会引起细胞膜表面脂质聚合现象，对细胞融合是必要的，但是否与脂筏区域蛋白有关，目前国外仅在EBV、HIV、HSV三种病毒做了部分研究工作，国内尚无此方面的报道。因此本项目拟通过检测包膜糖蛋白与脂筏区域结合的情况，表明其相互关系，阐明该病毒侵入细胞的吸附机制。并弄清抑胆固醇制剂和胆固醇类物质在该病毒吸附过程中所起的作用，为今后进一步研发抗包膜病毒（如流感病毒、麻疹病毒等）生物制剂提供实验依据，更为明确HHV-6B吸附受体奠定基础。 　　三、国内外研究现状： 　　近年来由于微生物的进化和突变导致出现新的病原体，使得人体免疫系统措不及防。再加上生态环境改变、不良行为方式、全球气候变暖、免疫受损人群增多等社会因素，使新发传染病逐渐增多，如SARS病毒、禽流感病毒等，给人类身心健康带来了极大的威胁。因此控制和预防新发传染病的发生是目前亟待解决的问题，特别是病原体入侵机制、传播途径、致病方式等研究显得尤为重要。 　　目前，国外学者在脂筏与信号传导关系上做了大量的研究，但是关于病毒与脂筏关系方面只做了EBV、HIV、HSV的相关研究。国内对病毒与脂筏关系的研究尚处于起步阶段，关于HHV-6B与脂筏相关性的研究，国内外未见报道。 　　四、研究起止时间： 　　2006年3月～2008年3月。 　　五、研究概况及主要技术内容： 　　本课题在具体实施过程中主要包括了以下的研究内容： 　　1、HHV-6B感染易感细胞、纯化与鉴定； 　　2、HHV-6B感染细胞脂筏的提取与病毒糖蛋白的检测； 　　3、降胆固醇制剂和胆固醇存在状态下对HHV-6B进入MT4细胞的影响，及其对病毒包膜糖蛋白表达的影响。 　　所包括的技术指标主要有： 　　1、HHV-6B感染细胞系的建立； 　　2、PCR法、蛋白印迹法、斑点杂交法进行病毒鉴定； 　　3、感染细胞脂筏的提取，Western blotting检测病毒包膜糖蛋白gQ和gL； 　　4、IFA法、流式细胞仪检测抑胆固醇制剂（甲基-β-环糊精等）和胆固醇对HHV-6B感染MT4细胞的影响； 　　5、IFA法、Western blotting 检测抑胆固醇制剂（甲基-β-环糊精等）和胆固醇对HHV-6B感染MT4后蛋白表达的影响。 　　在具体实施过程中，HHV-6B感染MT4 H2 细胞株时，关键在于病毒与细胞作用温度及时间，尤其是病毒感染后的纯化与鉴定，纯化的方法目前有很多，但是最理想的对病毒颗粒损伤最小的则是蔗糖密度梯度离心。因此，蔗糖密度梯度的制备是关键。通过本试验的实践，总结和摸索出了病毒纯化后的优化的鉴定技术则是PCR法与斑点杂交相结合（已有论文发表）。脂筏的提取在于裂解液的配制、过夜高速离心及离心后样品的收集和鉴定方法。本试验采用了蛋白印迹检测包膜糖蛋白与脂筏区域结合的客观依据。同时本试验进一步进行了曾用于降胆固醇的制剂来去除病毒包膜脂类后，对该病毒感染细胞性能的影响，目的是为未来研发抗包膜病毒制剂提供一定的试验基础 　　六、创新点： 　　在细胞水平上探讨HHV-6B病毒与细胞膜脂筏相关性； 　　针对有包膜病毒的吸附感染机制进行研究。 　　七、社会经济效益及存在的问题： 　　通过研究表明了HHV-6B包膜糖蛋白与脂筏有一定的相互关系，可进一步研究脂筏介导该病毒吸附和入侵的机制，最终提供控制有包膜病毒（如流感病毒，腮腺炎病毒等）感染性制剂研发的策略和方向。所取得的研究成果通过参加国内、国际学术会议，或者发表高水平的学术论文进一步推广。 　　研究表明HHV-6B包膜糖蛋白与脂筏区域蛋白相关，但尚需阐明该病毒侵入细胞的吸附、结合、进入机制，为今后进一步研发抗病毒的生物制剂提供翔实可靠的实验依据，更为明确HHV-6B吸附受体奠定基础。 　　研究中发现，检测指标设计的还不是很完全，如病毒吸附现象应加电镜检查结果，论据会更充分；研究还应更深入些，如实验中检测出包膜糖蛋白与脂筏区域结合，但具体与哪种蛋白结合并未得到证实，因此这也是本研究继续深入研究的内容，可利用酵母双或三杂交方法等找到该种病毒结合受体，为明确HHV-6B感染细胞的机制提供科学的实验依据。

　　一、课题来源、项目编号和经费数额： 　　本课题来源于吉林省卫生厅重点实验室招标项目（2006年6月28日批准），项目编号为017，共获得资助金额1万元。 　　二、立题目的、意义及必要性： 　　人类疱疹病毒6型(human herpesvirus 6， HHV-6)首次分离于AIDS及淋巴细胞增殖紊乱的患者，有A、B(HHV-6A、HHV-6B)两个亚型。国内外研究表明HHV-6B与儿童重症肝炎、成人的疲劳综合症、多发性硬化症等多项疾病有关。该病毒为包膜病毒，对淋巴细胞有亲嗜性，进入细胞时靠病毒包膜糖蛋白与易感细胞表面受体结合。研究表明哺乳类等细胞的膜蛋白主要集中于细胞膜上富含鞘磷脂和胆固醇的脂质微区，以复合物形式发挥功能，这些脂质微区称之为脂筏（lipid raft）。脂筏类似蛋白质停泊的平台，与膜的信号传导、蛋白质分选均有密切的关系。病毒吸附细胞后，会引起细胞膜表面脂质聚合现象，对细胞融合是必要的，但是否与脂筏区域蛋白有关，目前国外仅在EBV、HIV、HSV三种病毒做了部分研究工作，国内尚无此方面的报道。因此本项目拟通过检测包膜糖蛋白与脂筏区域结合的情况，表明其相互关系，阐明该病毒侵入细胞的吸附机制。并弄清抑胆固醇制剂和胆固醇类物质在该病毒吸附过程中所起的作用，为今后进一步研发抗包膜病毒（如流感病毒、麻疹病毒等）生物制剂提供实验依据，更为明确HHV-6B吸附受体奠定基础。 　　三、国内外研究现状： 　　近年来由于微生物的进化和突变导致出现新的病原体，使得人体免疫系统措不及防。再加上生态环境改变、不良行为方式、全球气候变暖、免疫受损人群增多等社会因素，使新发传染病逐渐增多，如SARS病毒、禽流感病毒等，给人类身心健康带来了极大的威胁。因此控制和预防新发传染病的发生是目前亟待解决的问题，特别是病原体入侵机制、传播途径、致病方式等研究显得尤为重要。 　　目前，国外学者在脂筏与信号传导关系上做了大量的研究，但是关于病毒与脂筏关系方面只做了EBV、HIV、HSV的相关研究。国内对病毒与脂筏关系的研究尚处于起步阶段，关于HHV-6B与脂筏相关性的研究，国内外未见报道。 　　四、研究起止时间： 　　2006年3月～2008年3月。 　　五、研究概况及主要技术内容： 　　本课题在具体实施过程中主要包括了以下的研究内容： 　　1、HHV-6B感染易感细胞、纯化与鉴定； 　　2、HHV-6B感染细胞脂筏的提取与病毒糖蛋白的检测； 　　3、降胆固醇制剂和胆固醇存在状态下对HHV-6B进入MT4细胞的影响，及其对病毒包膜糖蛋白表达的影响。 　　所包括的技术指标主要有： 　　1、HHV-6B感染细胞系的建立； 　　2、PCR法、蛋白印迹法、斑点杂交法进行病毒鉴定； 　　3、感染细胞脂筏的提取，Western blotting检测病毒包膜糖蛋白gQ和gL； 　　4、IFA法、流式细胞仪检测抑胆固醇制剂（甲基-β-环糊精等）和胆固醇对HHV-6B感染MT4细胞的影响； 　　5、IFA法、Western blotting 检测抑胆固醇制剂（甲基-β-环糊精等）和胆固醇对HHV-6B感染MT4后蛋白表达的影响。 　　在具体实施过程中，HHV-6B感染MT4 H2 细胞株时，关键在于病毒与细胞作用温度及时间，尤其是病毒感染后的纯化与鉴定，纯化的方法目前有很多，但是最理想的对病毒颗粒损伤最小的则是蔗糖密度梯度离心。因此，蔗糖密度梯度的制备是关键。通过本试验的实践，总结和摸索出了病毒纯化后的优化的鉴定技术则是PCR法与斑点杂交相结合（已有论文发表）。脂筏的提取在于裂解液的配制、过夜高速离心及离心后样品的收集和鉴定方法。本试验采用了蛋白印迹检测包膜糖蛋白与脂筏区域结合的客观依据。同时本试验进一步进行了曾用于降胆固醇的制剂来去除病毒包膜脂类后，对该病毒感染细胞性能的影响，目的是为未来研发抗包膜病毒制剂提供一定的试验基础 　　六、创新点： 　　在细胞水平上探讨HHV-6B病毒与细胞膜脂筏相关性； 　　针对有包膜病毒的吸附感染机制进行研究。 　　七、社会经济效益及存在的问题： 　　通过研究表明了HHV-6B包膜糖蛋白与脂筏有一定的相互关系，可进一步研究脂筏介导该病毒吸附和入侵的机制，最终提供控制有包膜病毒（如流感病毒，腮腺炎病毒等）感染性制剂研发的策略和方向。所取得的研究成果通过参加国内、国际学术会议，或者发表高水平的学术论文进一步推广。 　　研究表明HHV-6B包膜糖蛋白与脂筏区域蛋白相关，但尚需阐明该病毒侵入细胞的吸附、结合、进入机制，为今后进一步研发抗病毒的生物制剂提供翔实可靠的实验依据，更为明确HHV-6B吸附受体奠定基础。 　　研究中发现，检测指标设计的还不是很完全，如病毒吸附现象应加电镜检查结果，论据会更充分；研究还应更深入些，如实验中检测出包膜糖蛋白与脂筏区域结合，但具体与哪种蛋白结合并未得到证实，因此这也是本研究继续深入研究的内容，可利用酵母双或三杂交方法等找到该种病毒结合受体，为明确HHV-6B感染细胞的机制提供科学的实验依据。