本课题应用分子克隆、细胞培养、流式细胞、基因芯片技术，首先在体外进行Bcl-2 cDNA的克隆与表达，在突变位点附近设计引物，分别进行PCR扩增，得到含有突变位点的全长片段后构建到pET41a(+)上，连接原核表达载体PET41a的Bcl-2 基因和在该基因Loop Domain中突变的质粒，基因连接到真核表达载体PcDNA3上，构建正常和突变Bcl-2基因的真核表达质粒，酶切鉴定，测序，扩增纯化，用于细胞转染；脂质体介导，分别将（1）空载体质粒、（2）携带Bcl-2 基因质粒和携带突变基因的质粒转染NIH3T3细胞，转染后用TNF-α刺激细胞诱导凋亡，应用流式细胞仪检测各组凋亡情况，应用基因芯片检测各组细胞基因表达谱的变化。 通过本课题成功构建Bcl-2基因和Loop domain中突变的真核表达载体；成功将携带突变基因、野生基因的质粒转染入NIH3T3细胞；各组转染后用TNF刺激细胞诱导凋亡，流式细胞仪检测发现，转染Bcl-2基因的NIH3T3细胞凋亡较少，转染Loop domain突变的真核表达载体的NIH3T3细胞凋亡较明显，与转染空质粒组细胞具有显著性差异；基因芯片检测发现：转染Bcl-2基因的NIH3T3细胞凋亡基因下调，转染Loop domain突变的真核表达载体的NIH3T3细胞凋亡基因上调。 通过本课题研究证实Bcl-2基因Loop domain结构域突变对Bcl-2基因功能产生明显影响，Bcl-2基因Loop domain结构域突变前后使NIH3T3细胞凋亡产生明显变化，进一步证实Bcl-2基因Loop domain结构域在Bcl-2基因抗凋亡方面发挥重要作用。 成纤维细胞是创伤修复过程中最主要的功能细胞之一，研究和调控成纤维细胞的生物学行为是加速伤口愈合、提高愈合质量、预防包括瘢痕异常增生之内的多种纤维化疾病和慢性难愈性创面的基础与关键。创伤局部Bcl-2含量下降是成纤维细胞凋亡增加的重要原因。本课题以成纤维细胞NIH3T3作为细胞模型，证实Bcl-2基因Loop domain结构域在Bcl-2基因抗凋亡方面发挥重要作用，对于研究Bcl-2抑制凋亡的分子机制、寻找拮抗细胞凋亡的靶分子具有重要意义，对于临床创伤修复治疗具有潜在应用价值。

本课题应用分子克隆、细胞培养、流式细胞、基因芯片技术，首先在体外进行Bcl-2 cDNA的克隆与表达，在突变位点附近设计引物，分别进行PCR扩增，得到含有突变位点的全长片段后构建到pET41a(+)上，连接原核表达载体PET41a的Bcl-2 基因和在该基因Loop Domain中突变的质粒，基因连接到真核表达载体PcDNA3上，构建正常和突变Bcl-2基因的真核表达质粒，酶切鉴定，测序，扩增纯化，用于细胞转染；脂质体介导，分别将（1）空载体质粒、（2）携带Bcl-2 基因质粒和携带突变基因的质粒转染NIH3T3细胞，转染后用TNF-α刺激细胞诱导凋亡，应用流式细胞仪检测各组凋亡情况，应用基因芯片检测各组细胞基因表达谱的变化。 通过本课题成功构建Bcl-2基因和Loop domain中突变的真核表达载体；成功将携带突变基因、野生基因的质粒转染入NIH3T3细胞；各组转染后用TNF刺激细胞诱导凋亡，流式细胞仪检测发现，转染Bcl-2基因的NIH3T3细胞凋亡较少，转染Loop domain突变的真核表达载体的NIH3T3细胞凋亡较明显，与转染空质粒组细胞具有显著性差异；基因芯片检测发现：转染Bcl-2基因的NIH3T3细胞凋亡基因下调，转染Loop domain突变的真核表达载体的NIH3T3细胞凋亡基因上调。 通过本课题研究证实Bcl-2基因Loop domain结构域突变对Bcl-2基因功能产生明显影响，Bcl-2基因Loop domain结构域突变前后使NIH3T3细胞凋亡产生明显变化，进一步证实Bcl-2基因Loop domain结构域在Bcl-2基因抗凋亡方面发挥重要作用。 成纤维细胞是创伤修复过程中最主要的功能细胞之一，研究和调控成纤维细胞的生物学行为是加速伤口愈合、提高愈合质量、预防包括瘢痕异常增生之内的多种纤维化疾病和慢性难愈性创面的基础与关键。创伤局部Bcl-2含量下降是成纤维细胞凋亡增加的重要原因。本课题以成纤维细胞NIH3T3作为细胞模型，证实Bcl-2基因Loop domain结构域在Bcl-2基因抗凋亡方面发挥重要作用，对于研究Bcl-2抑制凋亡的分子机制、寻找拮抗细胞凋亡的靶分子具有重要意义，对于临床创伤修复治疗具有潜在应用价值。