任务来源：计划外自选项目。 背景、应用领域和技术原理：该成果主要应用于体外受精和胚胎移植周期中多余胚胎的冷冻保存。胚胎冷冻是IVF工作中不可缺少的重要组成部分。多数文献在随机的对比研究中报道，与早卵裂期胚胎相比，囊胚移植可获得较高的植入率和妊娠率。而随着囊胚移植的发展，囊胚冷冻势在必行。国内的胚胎冷冻技术拘泥于程序冷冻。程序冷冻囊胚存活率低。文献报道程序冷冻囊胚操作复杂，费时长，需要2-3h；需要较为昂贵的设备（程序式降温仪）；对胚胎造成的损伤较大。玻璃化冷冻是将胚胎在适当的冷冻保护剂混合液中做短暂处理后，直接投入液氮中，高浓度的冷冻保护剂（约5～8mol/L）在超低温环境下凝固，形成无规则的玻璃化固体，无任何冰晶形成，这种固态物质能保持液态时的正常分子与离子分布，而且在整个复温步骤中维持这种状态，其简便、经济，减少了由于细胞内冰晶形成所引起的一系列物理及化学损伤，使存活率提高。绝大部分的玻璃化冷冻都使用麦管盛装胚胎，限制了降温和复温速度的提高。改善冷冻载体的结构，减小样本体积，使样本与液氮直接接触，能明显提高降温速度。提高降温速度有利于胚胎迅速通过危险温度地带减少损伤，也有利于采用较低浓度的保护剂，减少毒性和渗透损伤。国外已有囊胚冷冻保存获妊娠分娩的报道，但其冷冻方案及相关技术条件不统一，尚还有很多需要探讨完善的环节，且国内报道甚少。因此探索成熟的囊胚玻璃化冷冻技术，提高玻璃化的冷冻效率是研究的热点。本课题以实验动物小鼠的囊胚为模型，分别研究了三种不同玻璃化冷冻载体、不同发育阶段囊胚以及冻前人工皱缩扩张期囊胚后的玻璃化冷冻效果，为辅助生育技术中建立可靠的囊胚玻璃化冷冻保存方法奠定实验室依据。 性能指标： ①分别应用普通麦管、拉细麦管、冷冻环三种不同冷冻载体玻璃化冷冻小鼠早期囊胚，以同期未冷冻早期囊胚作对照，观察冷冻复苏后胚胎存活率及继续发育能力。结果显示：复苏后胚胎丢失率：冷冻环组显著低于普通麦管组和CPS组（P<0.05）；存活率：冷冻环组和CPS组均高于普通麦管组，差异有显著性意义（P<0.05）；囊胚孵出率：冷冻环组高于CPS组，二者之间有显著性差异（P<0.05），冷冻环组与对照组（同期新鲜未冷冻的早期囊胚）比较无显著性差异（P＞0.05）。 ②应用冷冻环玻璃化冷冻小鼠的囊胚，胚胎按发育阶段分为4组：冷冻小鼠早期囊胚112个、囊胚120个、扩张囊胚105个，以同期未冷冻囊胚作对照（100个），观察冷冻复苏后胚胎存活率及继续发育能力。结果显示：早期囊胚复苏后的存活率和囊胚孵出率均高于囊胚和扩张囊胚（P<0.05）。 ③小鼠扩张期囊胚分为三组：a.人工皱缩组、b.未皱缩组、c.对照组。人工皱缩组：冻前先应用自制的玻璃微细管进行人工缩小小鼠囊胚腔后，再应用冷冻环分别玻璃化冷冻小鼠扩张期囊胚，冻融后培养3h观察胚胎存活情况，设同期培养的新鲜扩张囊胚为对照，并将存活胚胎及新鲜未冻囊胚移植受体孕鼠子宫内，观察胚胎的妊娠率和产仔率。结果显示：人工皱缩后小鼠扩张囊胚的存活率及孵出率均显著高于未皱缩组（P<0.05），皱缩组与对照无显著差异（P＞0.05）。移植后皱缩组的妊娠率及产仔率均显著高于未皱缩组（P<0.05），皱缩组与对照组无显著差异（P＞0.05）。 应用前景：与国内外同类技术比较，玻璃化冷冻囊胚国外已有成功保存并获妊娠的报道，其冷冻方案及相关技术条件不统一，尚还有很多需要探讨完善的环节；国内报道不多，尚无成熟的囊胚玻璃化冷冻方案。因此探索成熟的囊胚玻璃化冷冻技术，提高玻璃化的冷冻效率是研究的热点。而选择毒性低的冷冻保护剂、提高降温速度是首要条件。本课题研究者以实验动物小鼠的囊胚为模型，分别研究了三种不同玻璃化冷冻载体、不同发育阶段囊胚以及冻前人工皱缩扩张期囊胚后的玻璃化冷冻效果，已将实验引进临床应用的阶段，为辅助生育技术中建立可靠的囊胚玻璃化冷冻保存方法奠定实验室依据，在国内处于领先地位。 成果的创造性、先进性：该项成果在国内属率先研究了普通麦管、拉细麦管和冷冻环三种不同玻璃化冷冻载体、不同发育阶段囊胚以及冻前人工皱缩扩张期囊胚腔后应用冷冻环的玻璃化冷冻效果，研究出采用玻璃微吸管人工皱缩扩张期囊胚腔后应用冷冻环玻璃化冷冻囊胚这一新技术，具有一定的创造性，属国内先进水平。 技术成熟度、适用范围和安全性：该成果以实验动物小鼠的囊胚为模型，分别研究了影响囊胚玻璃化冷冻的重要环节、囊胚的发育阶段对玻璃化冷冻效果的影响、人工皱缩后对玻璃化冷冻小鼠囊胚效果的影响，已将实验引进临床应用的阶段，为辅助生育技术中建立可靠的囊胚玻璃化冷冻保存方法奠定实验室依据，对辅助生殖技术临床推广应用该技术具有很好的指导意义。采用玻璃微吸管人工皱缩囊胚腔后应用冷冻环玻璃化冷冻囊胚这一技术已在数家医院推广应用证明，均取很好效果，与程序冷冻比较具有简便、经济，存活率高等优点，并可获得满意的妊娠率，已足以证明其为安全、可靠的技术。人类囊胚冷冻已经成为辅助生殖技术进步的客观要求，国外已获得妊娠成功。而且，迄今为止，世界上玻璃化冻融人囊胚移植后成功分娩的报道中，尚未发现有遗传及表型异常者，已证实了它的可行性及临床应用价值。 推广应用的范围、条件和前景以及存在的问题： 该成果通过以实验动物小鼠的囊胚为模型，阐明了囊胚玻璃化冷冻技术的影响因素，并研究出玻璃微吸管人工皱缩囊胚腔后应用冷冻环玻璃化冷冻囊胚这一技术，作为一种囊胚的冷冻保存技术，若能在临床推广应用，不但应用于人类辅助生殖技术领域胚胎的保存，对于科研领域中稀有动物的保种、转基因技术中胚胎的保存等等都有很好的推广应有价值。 随着玻璃化冷冻方法的逐渐改进，有望以其简便、经济等诸多优点成为程序冷冻方法外的另一种选择。但是还需要进一步探索成熟的囊胚玻璃化冷冻技术。

任务来源：计划外自选项目。 背景、应用领域和技术原理：该成果主要应用于体外受精和胚胎移植周期中多余胚胎的冷冻保存。胚胎冷冻是IVF工作中不可缺少的重要组成部分。多数文献在随机的对比研究中报道，与早卵裂期胚胎相比，囊胚移植可获得较高的植入率和妊娠率。而随着囊胚移植的发展，囊胚冷冻势在必行。国内的胚胎冷冻技术拘泥于程序冷冻。程序冷冻囊胚存活率低。文献报道程序冷冻囊胚操作复杂，费时长，需要2-3h；需要较为昂贵的设备（程序式降温仪）；对胚胎造成的损伤较大。玻璃化冷冻是将胚胎在适当的冷冻保护剂混合液中做短暂处理后，直接投入液氮中，高浓度的冷冻保护剂（约5～8mol/L）在超低温环境下凝固，形成无规则的玻璃化固体，无任何冰晶形成，这种固态物质能保持液态时的正常分子与离子分布，而且在整个复温步骤中维持这种状态，其简便、经济，减少了由于细胞内冰晶形成所引起的一系列物理及化学损伤，使存活率提高。绝大部分的玻璃化冷冻都使用麦管盛装胚胎，限制了降温和复温速度的提高。改善冷冻载体的结构，减小样本体积，使样本与液氮直接接触，能明显提高降温速度。提高降温速度有利于胚胎迅速通过危险温度地带减少损伤，也有利于采用较低浓度的保护剂，减少毒性和渗透损伤。国外已有囊胚冷冻保存获妊娠分娩的报道，但其冷冻方案及相关技术条件不统一，尚还有很多需要探讨完善的环节，且国内报道甚少。因此探索成熟的囊胚玻璃化冷冻技术，提高玻璃化的冷冻效率是研究的热点。本课题以实验动物小鼠的囊胚为模型，分别研究了三种不同玻璃化冷冻载体、不同发育阶段囊胚以及冻前人工皱缩扩张期囊胚后的玻璃化冷冻效果，为辅助生育技术中建立可靠的囊胚玻璃化冷冻保存方法奠定实验室依据。 性能指标： ①分别应用普通麦管、拉细麦管、冷冻环三种不同冷冻载体玻璃化冷冻小鼠早期囊胚，以同期未冷冻早期囊胚作对照，观察冷冻复苏后胚胎存活率及继续发育能力。结果显示：复苏后胚胎丢失率：冷冻环组显著低于普通麦管组和CPS组（P<0.05）；存活率：冷冻环组和CPS组均高于普通麦管组，差异有显著性意义（P<0.05）；囊胚孵出率：冷冻环组高于CPS组，二者之间有显著性差异（P<0.05），冷冻环组与对照组（同期新鲜未冷冻的早期囊胚）比较无显著性差异（P＞0.05）。 ②应用冷冻环玻璃化冷冻小鼠的囊胚，胚胎按发育阶段分为4组：冷冻小鼠早期囊胚112个、囊胚120个、扩张囊胚105个，以同期未冷冻囊胚作对照（100个），观察冷冻复苏后胚胎存活率及继续发育能力。结果显示：早期囊胚复苏后的存活率和囊胚孵出率均高于囊胚和扩张囊胚（P<0.05）。 ③小鼠扩张期囊胚分为三组：a.人工皱缩组、b.未皱缩组、c.对照组。人工皱缩组：冻前先应用自制的玻璃微细管进行人工缩小小鼠囊胚腔后，再应用冷冻环分别玻璃化冷冻小鼠扩张期囊胚，冻融后培养3h观察胚胎存活情况，设同期培养的新鲜扩张囊胚为对照，并将存活胚胎及新鲜未冻囊胚移植受体孕鼠子宫内，观察胚胎的妊娠率和产仔率。结果显示：人工皱缩后小鼠扩张囊胚的存活率及孵出率均显著高于未皱缩组（P<0.05），皱缩组与对照无显著差异（P＞0.05）。移植后皱缩组的妊娠率及产仔率均显著高于未皱缩组（P<0.05），皱缩组与对照组无显著差异（P＞0.05）。 应用前景：与国内外同类技术比较，玻璃化冷冻囊胚国外已有成功保存并获妊娠的报道，其冷冻方案及相关技术条件不统一，尚还有很多需要探讨完善的环节；国内报道不多，尚无成熟的囊胚玻璃化冷冻方案。因此探索成熟的囊胚玻璃化冷冻技术，提高玻璃化的冷冻效率是研究的热点。而选择毒性低的冷冻保护剂、提高降温速度是首要条件。本课题研究者以实验动物小鼠的囊胚为模型，分别研究了三种不同玻璃化冷冻载体、不同发育阶段囊胚以及冻前人工皱缩扩张期囊胚后的玻璃化冷冻效果，已将实验引进临床应用的阶段，为辅助生育技术中建立可靠的囊胚玻璃化冷冻保存方法奠定实验室依据，在国内处于领先地位。 成果的创造性、先进性：该项成果在国内属率先研究了普通麦管、拉细麦管和冷冻环三种不同玻璃化冷冻载体、不同发育阶段囊胚以及冻前人工皱缩扩张期囊胚腔后应用冷冻环的玻璃化冷冻效果，研究出采用玻璃微吸管人工皱缩扩张期囊胚腔后应用冷冻环玻璃化冷冻囊胚这一新技术，具有一定的创造性，属国内先进水平。 技术成熟度、适用范围和安全性：该成果以实验动物小鼠的囊胚为模型，分别研究了影响囊胚玻璃化冷冻的重要环节、囊胚的发育阶段对玻璃化冷冻效果的影响、人工皱缩后对玻璃化冷冻小鼠囊胚效果的影响，已将实验引进临床应用的阶段，为辅助生育技术中建立可靠的囊胚玻璃化冷冻保存方法奠定实验室依据，对辅助生殖技术临床推广应用该技术具有很好的指导意义。采用玻璃微吸管人工皱缩囊胚腔后应用冷冻环玻璃化冷冻囊胚这一技术已在数家医院推广应用证明，均取很好效果，与程序冷冻比较具有简便、经济，存活率高等优点，并可获得满意的妊娠率，已足以证明其为安全、可靠的技术。人类囊胚冷冻已经成为辅助生殖技术进步的客观要求，国外已获得妊娠成功。而且，迄今为止，世界上玻璃化冻融人囊胚移植后成功分娩的报道中，尚未发现有遗传及表型异常者，已证实了它的可行性及临床应用价值。 推广应用的范围、条件和前景以及存在的问题： 该成果通过以实验动物小鼠的囊胚为模型，阐明了囊胚玻璃化冷冻技术的影响因素，并研究出玻璃微吸管人工皱缩囊胚腔后应用冷冻环玻璃化冷冻囊胚这一技术，作为一种囊胚的冷冻保存技术，若能在临床推广应用，不但应用于人类辅助生殖技术领域胚胎的保存，对于科研领域中稀有动物的保种、转基因技术中胚胎的保存等等都有很好的推广应有价值。 随着玻璃化冷冻方法的逐渐改进，有望以其简便、经济等诸多优点成为程序冷冻方法外的另一种选择。但是还需要进一步探索成熟的囊胚玻璃化冷冻技术。