1. 任务来源：本项目是河南省科技攻关计划项目（编号0523031700） 2. 应用领域和技术原理： 类杆菌是一群G-无芽孢厌氧杆菌，是机体肠道中重要的正常菌群，也是条件致病菌。资料表明：临床上由G-杆菌引起的内源性感染常见，约占43%，致病菌种常为G-无芽孢厌氧杆菌中的类杆菌和梭杆菌、G-杆菌兼性菌中的肠杆菌等。类杆菌常规检测和鉴定采用厌氧培养方法，需3到5天，不能及时报告结果。临床医生诊治此类混合或单独厌氧菌感染时，难度大，疗效不好。因此，及时明确病因，采用针对性抗感染药物治疗，具有重要临床意义，也是合理用药的重要内容。 随着分子生物学的发展，以PCR为基础检测病原微生物技术得到迅速发展。鉴定时间在4小时到1天。已有资料表明，以16S rRNA基因为靶基因检出和鉴定大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、葡萄球菌等需氧菌或兼性菌；以16S rRNA基因为靶基因鉴定厌氧菌中脆弱类杆菌、多形类杆菌、双歧杆菌。有关以16S rRNA基因为靶基因选用通用引物，鉴定类杆菌属的资料较少。本研究以16S rRNA基因为靶基因，设计在类杆菌中常见的脆弱类杆菌、多形、普通、卵圆形、吉氏、单形类杆菌的通用引物和通用探针，用荧光定量PCR技术（TaqMAN探针法）定性或定量检测类杆菌；同肠杆菌等45株分离菌、人类单个核细胞基因组DNA、HBV-DNA作特异性检出试验，混合标本中目的菌检出试验。 3.结果： 3.1 类杆菌16S rRNA 基因通用引物设计、合成，普通PCR扩增，凝胶电泳分析鉴定：13株类杆菌（6个菌种）在预计位置640bp（第一对引物）、190 bp（第三对引物）处出现条带。最低检测菌量为100个基因组。以程序不同，特异性分别为60/60（100.00%）、56/60（93.33%）、55/60（91.67%） 3.2 类杆菌荧光定量PCR检测方法建立：分别进行通用引物和通用探针的设计、标准曲线制备、灵敏度测定。13株类杆菌（6个菌种）有扩增曲线，最低检测菌量为10个基因组。特异性为60/60（100.00%）。通过建立标准曲线，可定量测定目的菌。 3.3 15例混合标本（大肠埃希菌109：类杆菌104）中，用荧光定量PCR法检测目的菌，类杆菌检出，大肠埃希菌未检出。高浓度的非目的菌不影响低浓度的类杆菌的检出。 3.4 14株脆弱类杆菌经普通PCR扩增，凝胶电泳，在预计位置176bp处出现条带。测序结果与GenBank上脆弱类杆菌的16S rRNA 基因序列符合。最低检测菌量为100个基因组。特异性为21/22（95.45%）。 3.5 脆弱类杆菌的16S rRNA 基因荧光定量PCR检测方法建立：14株脆弱类杆有扩增曲线，最低检测菌量为10个基因组。特异性为22/22(100.00%).通过建立标准曲线，可定量测定目的菌。 3.6采用直接计数法制备标准品和普通PCR产物制备标准品分别定量检测脆弱类杆菌。结果为直接计数法检测脆弱类杆菌其数量高于使用PCR产物。 3.7 发现一株类杆菌新的16S rRNA 基因，已被收录在GenBank 目录中。 3.8 14株类杆菌同源性分析及进化树。 3.9，临床实验报告结果表明，检测血液和尿标本的阳性率高于常规细菌培养鉴定方法。 4.国内外同类技术比较和成果的创造性、先进性： 有关类杆菌的16S rRNA 基因通用引物设计、合成，普通PCR扩增，凝胶电泳分析鉴定，类杆菌荧光定量PCR检测的研究，国内外研究水平基本同步。 经河南省医学情报研究所检索国内外有关文献，综合结论：国内文献中未检出类杆菌及脆弱类杆菌荧光定量PCR检测的文献报道。本项目中有关类杆菌及脆弱类杆菌荧光定量PCR检测，MEDLINE检出有同类文献，但研究中选用的特异性试验用菌株和方法与文献报道不同。 5.应用前景 5.1社会效益：有助于本省及国内开展厌氧菌检测工作。降低患者个体治疗费，标本中类杆菌常规检出和鉴定用时为3～5天，本项目缩短至4小时到1天；减少患者在此前广谱用药2～4天，如按一天50元药费计费，可节省100～200元。广谱用药是导致二重感染的潜在原因之一，故可在一定程度上减少二重感染的发生率。减少患者住院费用，如按一天30元床位费计费，可节省60～240元。合理用药，消除医患在用药方面矛盾，有助于医患和谐，相互理解。 5.2 经济效益：用本项目建立的检测方法可直接检测临床体液标本中类杆菌，获得经济效益。按检测一例厌氧菌收费100～150元计费，每天检测20例，按每月25个工作日计，预计月收入为5万～7.5万。 减少住院时间，可加快床位周转率，提高医院科室整体经济效益。 5.3.应用范围：应用于医疗、食品行业，牧医、家禽，生物工程。应用广泛。

1. 任务来源：本项目是河南省科技攻关计划项目（编号0523031700） 2. 应用领域和技术原理： 类杆菌是一群G-无芽孢厌氧杆菌，是机体肠道中重要的正常菌群，也是条件致病菌。资料表明：临床上由G-杆菌引起的内源性感染常见，约占43%，致病菌种常为G-无芽孢厌氧杆菌中的类杆菌和梭杆菌、G-杆菌兼性菌中的肠杆菌等。类杆菌常规检测和鉴定采用厌氧培养方法，需3到5天，不能及时报告结果。临床医生诊治此类混合或单独厌氧菌感染时，难度大，疗效不好。因此，及时明确病因，采用针对性抗感染药物治疗，具有重要临床意义，也是合理用药的重要内容。 随着分子生物学的发展，以PCR为基础检测病原微生物技术得到迅速发展。鉴定时间在4小时到1天。已有资料表明，以16S rRNA基因为靶基因检出和鉴定大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、葡萄球菌等需氧菌或兼性菌；以16S rRNA基因为靶基因鉴定厌氧菌中脆弱类杆菌、多形类杆菌、双歧杆菌。有关以16S rRNA基因为靶基因选用通用引物，鉴定类杆菌属的资料较少。本研究以16S rRNA基因为靶基因，设计在类杆菌中常见的脆弱类杆菌、多形、普通、卵圆形、吉氏、单形类杆菌的通用引物和通用探针，用荧光定量PCR技术（TaqMAN探针法）定性或定量检测类杆菌；同肠杆菌等45株分离菌、人类单个核细胞基因组DNA、HBV-DNA作特异性检出试验，混合标本中目的菌检出试验。 3.结果： 3.1 类杆菌16S rRNA 基因通用引物设计、合成，普通PCR扩增，凝胶电泳分析鉴定：13株类杆菌（6个菌种）在预计位置640bp（第一对引物）、190 bp（第三对引物）处出现条带。最低检测菌量为100个基因组。以程序不同，特异性分别为60/60（100.00%）、56/60（93.33%）、55/60（91.67%） 3.2 类杆菌荧光定量PCR检测方法建立：分别进行通用引物和通用探针的设计、标准曲线制备、灵敏度测定。13株类杆菌（6个菌种）有扩增曲线，最低检测菌量为10个基因组。特异性为60/60（100.00%）。通过建立标准曲线，可定量测定目的菌。 3.3 15例混合标本（大肠埃希菌109：类杆菌104）中，用荧光定量PCR法检测目的菌，类杆菌检出，大肠埃希菌未检出。高浓度的非目的菌不影响低浓度的类杆菌的检出。 3.4 14株脆弱类杆菌经普通PCR扩增，凝胶电泳，在预计位置176bp处出现条带。测序结果与GenBank上脆弱类杆菌的16S rRNA 基因序列符合。最低检测菌量为100个基因组。特异性为21/22（95.45%）。 3.5 脆弱类杆菌的16S rRNA 基因荧光定量PCR检测方法建立：14株脆弱类杆有扩增曲线，最低检测菌量为10个基因组。特异性为22/22(100.00%).通过建立标准曲线，可定量测定目的菌。 3.6采用直接计数法制备标准品和普通PCR产物制备标准品分别定量检测脆弱类杆菌。结果为直接计数法检测脆弱类杆菌其数量高于使用PCR产物。 3.7 发现一株类杆菌新的16S rRNA 基因，已被收录在GenBank 目录中。 3.8 14株类杆菌同源性分析及进化树。 3.9，临床实验报告结果表明，检测血液和尿标本的阳性率高于常规细菌培养鉴定方法。 4.国内外同类技术比较和成果的创造性、先进性： 有关类杆菌的16S rRNA 基因通用引物设计、合成，普通PCR扩增，凝胶电泳分析鉴定，类杆菌荧光定量PCR检测的研究，国内外研究水平基本同步。 经河南省医学情报研究所检索国内外有关文献，综合结论：国内文献中未检出类杆菌及脆弱类杆菌荧光定量PCR检测的文献报道。本项目中有关类杆菌及脆弱类杆菌荧光定量PCR检测，MEDLINE检出有同类文献，但研究中选用的特异性试验用菌株和方法与文献报道不同。 5.应用前景 5.1社会效益：有助于本省及国内开展厌氧菌检测工作。降低患者个体治疗费，标本中类杆菌常规检出和鉴定用时为3～5天，本项目缩短至4小时到1天；减少患者在此前广谱用药2～4天，如按一天50元药费计费，可节省100～200元。广谱用药是导致二重感染的潜在原因之一，故可在一定程度上减少二重感染的发生率。减少患者住院费用，如按一天30元床位费计费，可节省60～240元。合理用药，消除医患在用药方面矛盾，有助于医患和谐，相互理解。 5.2 经济效益：用本项目建立的检测方法可直接检测临床体液标本中类杆菌，获得经济效益。按检测一例厌氧菌收费100～150元计费，每天检测20例，按每月25个工作日计，预计月收入为5万～7.5万。 减少住院时间，可加快床位周转率，提高医院科室整体经济效益。 5.3.应用范围：应用于医疗、食品行业，牧医、家禽，生物工程。应用广泛。