传统方法治疗骨缺损、骨不连有很多弊端，骨组织工程则为人们提供了一条新路。但其实际应用的关键是成骨细胞成骨以修补骨缺损，其前提是找到良好的种子细胞。而目前种子细胞的老化是组织工程中的一大难题。一些分化和增殖能力强的原始细胞，即干细胞，是解决这一难题的希望所在。目前研究较多的是骨髓基质干细胞，但它却存在着： 1）相对低的产生率，大约100,000个细胞中才有1个真正的干细胞； 2）自我更新能力有限，而且随着时间的延长，增生潜能及向特殊类型细胞转化的能力均消失殆尽的问题。因此，基于骨组织工程的目的仍需发展一种新的细胞资源。而胚胎干细胞（embryonic stem cclls，ES）因其具有全能性和无限增殖的能力，有望成为组织工程中种子细胞的新来源。 前景虽然广阔，但具体到胚胎干细胞向成骨细胞转化的研究，还仅仅是处在起步阶段，目前国内的研究主要集中在诱导胚胎干细胞向神经细胞、心肌细胞、造血细胞等细胞方面转化，关于向成骨细胞转化，相关报道极少；国外的研究亦主要是从鼠类胚胎干细胞向成骨细胞转化。 ①BUTTERY L.D.于2001年提出补增含有维生素C以及β-甘油磷酸和/或地塞米松/维甲酸的含血清培养基或者通过含胎鼠成骨细胞的复合培养基能够促进ESC向成骨细胞转化。而且诱导效果取决于其应用时间。这些诱导因子在第14天之后而不是之前加入培养基最为有效。这就说明在ESC向成骨细胞转化过程中存在一些特殊时段，在这些时段内具有向成骨细胞系转化潜能的前体细胞的数量达到最高而且对地塞米松最为敏感。 ②同年Blaine W.Phillip等认为康帕丁（compactin）对于ESC向成骨细胞转化的完成非常重要。他们认为在维生素C以及β-甘油磷酸存在的情况下ESC能够在含有维甲酸的培养基内生长并表达骨钙素（osteocalcin），碱性磷酸酶，骨桥接素（osteopontin）等成骨细胞标志基因。然而矿化基质分泌物的量却很少，但是在加入骨形成蛋白-2（BMP-2）或康帕丁后，矿化骨小节的形成数目就大大提高了。康帕丁并不影响成骨细胞标志基因的表达，但在分化的晚期阶段却能够促进BMP-2表达的增加，进而增加ESC内矿化沉积从而加快骨化进程。 ③zur Nieden NI等于2003年提出经地塞米松或全反维甲酸（all-trans retinoic acid）处理可以诱导ESC向成骨细胞转化并在补增βGP和AA及1.25（OH）2 D3（VD3）后经历矿化过程。 本实验拟从小鼠原代胚胎干细胞的培养入手，通过在适宜的时段加入有效的诱导因子使胚胎干细胞向成骨细胞转化，并以此为契机开展人胚胎干细胞向成骨细胞转化的研究从而建立一条体外大量获取成骨细胞的途径，进而将之应用于骨组织工程的临床研究。 用13.5天左右的昆明小鼠胚胎，采用常温消化法制备小鼠胚胎原代成纤维细胞（PMEF），加入专用的DMEM培养液，经丝裂霉素C处理后成为饲养层。在昆明小鼠受精后第4天，从子宫中取囊胚进行体外培养，4～5天后，获得大的巢式生长集落，使用0.25％胰蛋白酶-0.02％ EDTA，采用两步离散法，对内细胞团集落进行离散，接种在新鲜制备的饲养层体系中，加入适宜的含有白血病抑制因子（LlF）的培养基进行分化抑制培养，并进行传代和体外扩增。采用碱性磷酸酶染色、核型分析、类胚体实验对扩增细胞进行ESC鉴定。将小鼠5天 龄ES-D3 细胞源的类胚体（Ebs）单细胞，按5×104/mL接种12孔细胞培养板，在DMEM基础培养基中使Ebs单细胞贴壁培养。于第14～21天时，分别添加50μg/mL维生素C、50 mmol/Lβ-磷酸甘油、1μmol/L 地塞米松（A组），50μg/mL维生素C、50 mmol/Lβ-磷酸甘油、1μmol/L 地塞米松、10ng/mL骨形成蛋白2（B组），并设不添加诱导剂对照组（C组）。第22天时用1％茜素红染色显示阳性细胞，计算成骨细胞诱导形成率，数据用方差分析和多重比较检验。

传统方法治疗骨缺损、骨不连有很多弊端，骨组织工程则为人们提供了一条新路。但其实际应用的关键是成骨细胞成骨以修补骨缺损，其前提是找到良好的种子细胞。而目前种子细胞的老化是组织工程中的一大难题。一些分化和增殖能力强的原始细胞，即干细胞，是解决这一难题的希望所在。目前研究较多的是骨髓基质干细胞，但它却存在着： 1）相对低的产生率，大约100,000个细胞中才有1个真正的干细胞； 2）自我更新能力有限，而且随着时间的延长，增生潜能及向特殊类型细胞转化的能力均消失殆尽的问题。因此，基于骨组织工程的目的仍需发展一种新的细胞资源。而胚胎干细胞（embryonic stem cclls，ES）因其具有全能性和无限增殖的能力，有望成为组织工程中种子细胞的新来源。 前景虽然广阔，但具体到胚胎干细胞向成骨细胞转化的研究，还仅仅是处在起步阶段，目前国内的研究主要集中在诱导胚胎干细胞向神经细胞、心肌细胞、造血细胞等细胞方面转化，关于向成骨细胞转化，相关报道极少；国外的研究亦主要是从鼠类胚胎干细胞向成骨细胞转化。 ①BUTTERY L.D.于2001年提出补增含有维生素C以及β-甘油磷酸和/或地塞米松/维甲酸的含血清培养基或者通过含胎鼠成骨细胞的复合培养基能够促进ESC向成骨细胞转化。而且诱导效果取决于其应用时间。这些诱导因子在第14天之后而不是之前加入培养基最为有效。这就说明在ESC向成骨细胞转化过程中存在一些特殊时段，在这些时段内具有向成骨细胞系转化潜能的前体细胞的数量达到最高而且对地塞米松最为敏感。 ②同年Blaine W.Phillip等认为康帕丁（compactin）对于ESC向成骨细胞转化的完成非常重要。他们认为在维生素C以及β-甘油磷酸存在的情况下ESC能够在含有维甲酸的培养基内生长并表达骨钙素（osteocalcin），碱性磷酸酶，骨桥接素（osteopontin）等成骨细胞标志基因。然而矿化基质分泌物的量却很少，但是在加入骨形成蛋白-2（BMP-2）或康帕丁后，矿化骨小节的形成数目就大大提高了。康帕丁并不影响成骨细胞标志基因的表达，但在分化的晚期阶段却能够促进BMP-2表达的增加，进而增加ESC内矿化沉积从而加快骨化进程。 ③zur Nieden NI等于2003年提出经地塞米松或全反维甲酸（all-trans retinoic acid）处理可以诱导ESC向成骨细胞转化并在补增βGP和AA及1.25（OH）2 D3（VD3）后经历矿化过程。 本实验拟从小鼠原代胚胎干细胞的培养入手，通过在适宜的时段加入有效的诱导因子使胚胎干细胞向成骨细胞转化，并以此为契机开展人胚胎干细胞向成骨细胞转化的研究从而建立一条体外大量获取成骨细胞的途径，进而将之应用于骨组织工程的临床研究。 用13.5天左右的昆明小鼠胚胎，采用常温消化法制备小鼠胚胎原代成纤维细胞（PMEF），加入专用的DMEM培养液，经丝裂霉素C处理后成为饲养层。在昆明小鼠受精后第4天，从子宫中取囊胚进行体外培养，4～5天后，获得大的巢式生长集落，使用0.25％胰蛋白酶-0.02％ EDTA，采用两步离散法，对内细胞团集落进行离散，接种在新鲜制备的饲养层体系中，加入适宜的含有白血病抑制因子（LlF）的培养基进行分化抑制培养，并进行传代和体外扩增。采用碱性磷酸酶染色、核型分析、类胚体实验对扩增细胞进行ESC鉴定。将小鼠5天 龄ES-D3 细胞源的类胚体（Ebs）单细胞，按5×104/mL接种12孔细胞培养板，在DMEM基础培养基中使Ebs单细胞贴壁培养。于第14～21天时，分别添加50μg/mL维生素C、50 mmol/Lβ-磷酸甘油、1μmol/L 地塞米松（A组），50μg/mL维生素C、50 mmol/Lβ-磷酸甘油、1μmol/L 地塞米松、10ng/mL骨形成蛋白2（B组），并设不添加诱导剂对照组（C组）。第22天时用1％茜素红染色显示阳性细胞，计算成骨细胞诱导形成率，数据用方差分析和多重比较检验。