本课题是福建省科技厅2002年下达的科研项目，编号C0210026。 造血干细胞移植配合大剂量化疗已成为治疗恶性白血病及某些实体瘤有效治疗手段，但大剂量化疗后体内长时期血小板减少是目前临床关注的焦点，我们希望利用造血干/祖细胞进行定向诱导分化、体外扩增巨核细胞，以期用于患者血小板数目及功能的恢复。 具体如下： ①脐血采集及CD34+细胞的分离纯化：采集足月正常分娩的胎儿脐带血，明胶﹢Ficoll法分离单个核细胞(MNC)，平均(1.79±0.75)×108，再用免疫磁株技术分选CD34+细胞，纯度达85～98﹪。 ②用TPO、SCF、IL-1β、IL-3、IL-6、IL-11、Flt-3L等搭配组合，刺激脐血CD34+细胞向巨核细胞系定向扩增，结果表明TPO＋SCF＋Flt-3L＋IL-1β＋IL-3＋IL-6的因子组合扩增作用最强，在第16天CD34+细胞、MNC及CD41+CD61+细胞扩增倍数分别达6.89、277.4及66.79。 ③比较TPO、PDGF、IL-11在促进巨核系增殖、分化及成熟过程中的不同效果。初步探讨巨核细胞分化过程中相关信号，通过蛋白的表达发现，TPO对巨核系的扩增效果明显强于PDGF和IL-11；IL-11对巨核系的作用是非特异的，它在促进巨核系祖细胞增殖的同时也促进其它各系祖细胞的增殖；IL-11对TPO、PDGF有协同作用，可促进多系祖细胞的增殖和分化；脐血CD34+细胞在TPO、SCF、IL-1β、IL-3、IL-6及IL-11等因子作用下，随着培养时间的延长，MAPK p42/p44蛋白表达并无明显改变，AKT蛋白亦未见明显变化，但磷酸化的p42和p44的表达却明显增加。巨核细胞集体培养证实TPO联合其他因子可诱导CD34+细胞形成CFU-MK，对巨核祖细胞具有促进增殖和分化作用。电镜检测证实TPO联合其他因子可诱导脐血CD34+细胞向巨核细胞系分化。 ④基因芯片杂交分析培养前CD34+干细胞和培养后CD41+巨核细胞，共筛选出3522个差异基因。其中，CD41基因的表达增加27.35倍，PF4基因，G蛋白偶联受体基因，PRK基因等均有表达上调，TNF受体家族，MAPK，RAS家族相关的基因下调。用RT-PCR方法对部分差异基因进行验证，结果与芯片检测完全一致。 巨核细胞的定向扩增及回输治疗适用于普通化疗后血小板低下患者，以及造血干细胞移植后血小板恢复缓慢的肿瘤患者，有较好的应用前景。

本课题是福建省科技厅2002年下达的科研项目，编号C0210026。 造血干细胞移植配合大剂量化疗已成为治疗恶性白血病及某些实体瘤有效治疗手段，但大剂量化疗后体内长时期血小板减少是目前临床关注的焦点，我们希望利用造血干/祖细胞进行定向诱导分化、体外扩增巨核细胞，以期用于患者血小板数目及功能的恢复。 具体如下： ①脐血采集及CD34+细胞的分离纯化：采集足月正常分娩的胎儿脐带血，明胶﹢Ficoll法分离单个核细胞(MNC)，平均(1.79±0.75)×108，再用免疫磁株技术分选CD34+细胞，纯度达85～98﹪。 ②用TPO、SCF、IL-1β、IL-3、IL-6、IL-11、Flt-3L等搭配组合，刺激脐血CD34+细胞向巨核细胞系定向扩增，结果表明TPO＋SCF＋Flt-3L＋IL-1β＋IL-3＋IL-6的因子组合扩增作用最强，在第16天CD34+细胞、MNC及CD41+CD61+细胞扩增倍数分别达6.89、277.4及66.79。 ③比较TPO、PDGF、IL-11在促进巨核系增殖、分化及成熟过程中的不同效果。初步探讨巨核细胞分化过程中相关信号，通过蛋白的表达发现，TPO对巨核系的扩增效果明显强于PDGF和IL-11；IL-11对巨核系的作用是非特异的，它在促进巨核系祖细胞增殖的同时也促进其它各系祖细胞的增殖；IL-11对TPO、PDGF有协同作用，可促进多系祖细胞的增殖和分化；脐血CD34+细胞在TPO、SCF、IL-1β、IL-3、IL-6及IL-11等因子作用下，随着培养时间的延长，MAPK p42/p44蛋白表达并无明显改变，AKT蛋白亦未见明显变化，但磷酸化的p42和p44的表达却明显增加。巨核细胞集体培养证实TPO联合其他因子可诱导CD34+细胞形成CFU-MK，对巨核祖细胞具有促进增殖和分化作用。电镜检测证实TPO联合其他因子可诱导脐血CD34+细胞向巨核细胞系分化。 ④基因芯片杂交分析培养前CD34+干细胞和培养后CD41+巨核细胞，共筛选出3522个差异基因。其中，CD41基因的表达增加27.35倍，PF4基因，G蛋白偶联受体基因，PRK基因等均有表达上调，TNF受体家族，MAPK，RAS家族相关的基因下调。用RT-PCR方法对部分差异基因进行验证，结果与芯片检测完全一致。 巨核细胞的定向扩增及回输治疗适用于普通化疗后血小板低下患者，以及造血干细胞移植后血小板恢复缓慢的肿瘤患者，有较好的应用前景。