1、任务来源： 本课题来源于沈阳市科委重点项目：《人胚胎干细胞的分离、建系及诱导分化为心肌细胞和神经细胞》，项目编号为：1032043-3-05 　　2、应用领域：人胚胎干细胞(embryonic stem cel，ES细胞)主要来自囊胚内细胞团及受精卵发育至桑椹胚之前的早期胚胎细胞，或者从胎儿生殖嵴分离得到的原生殖细胞以及体细胞核转移至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。人ES细胞具有2个显著特征：一是它具有体外高度自我更新的能力，二是它可被定向诱导分化为体内各种细胞类型。人ES细胞有着巨大的医学应用前景，它有可能作为“种子细胞”用于细胞替代疗法，即将人ES细胞定向诱导成某一类型的细胞，然后移植到机体的病变区，以治疗各种难治性疾病，如帕金森氏病、心肌梗死、糖尿病等；人胚胎干细胞有向各种组织分化的潜力。人们不仅可以获得需要的细胞，也有希望获得某个器官，甚至用经过基因改造的人胚胎干细胞培育出没有排斥反应的细胞、组织、器官；通过对其体外分化和定向分化的研究，识别某些靶基因，为人类新基因的发现及其功能的研究提供了一种新方法。 　　3、技术原理：（1）取在沈阳市妇婴医院行子宫切除术患者自愿捐献的子宫内膜及行药物流产患者自愿捐献的受精5～9周流产胎儿，捐献者知情同意，且伦理委员会通过。培养子宫内膜基质细胞，建立其培养系统，将子宫内膜基质细胞制备为饲养细胞。分离受精4～9孕周人胚胎的生殖嵴和肠系膜，将其置入子宫内膜基质细胞作为饲养层的培养体系内，分离培养人原始生殖细胞，并对其进行人类胚胎干细胞生物学特性的检测； 　　（2）行IVF/ICSI助孕患者自愿捐献的冷冻胚胎，捐赠者知情同意和医院伦理委员会讨论通过后，复苏冷冻的胚胎，用G1.3G2.3序贯培养法培养至囊胚，采用免疫外科法分离内细胞团，将其接种在胚胎鼠成纤维细胞饲养层上进行培养，直至干细胞集落出现。用机械法、胶原酶、胰酶法、Dispase法对ES细胞进行传代培养，并对其进行人类胚胎干细胞的生物学特性的检测。 　　4、性能指标： 　　（1）建立了人子宫内膜基质细胞作为饲养细胞的培养体系，成功地从选择性药物流产胎儿（5～9周）的生殖嵴、肠系膜分离原始生殖细胞，在国内外首次接种在人子宫内膜基质细胞饲养层上，进行传代培养4个多月。所培养的原始生殖细胞体积较大，核质比高，核内有2个以上的核仁，形态与人胚胎干细胞相似，具备人胚胎干细胞的所有生物学特性，如碱性磷酸酶阳性、SSEA-1阳性、SSEA-3阳性、SSEA-4阳性、TRA-1-81阳性、TRA-1-60阳性、OCT-4阳性，细胞保持正常的染色体核型46、XX；具有人胚胎干细胞的所有生物学特性，如碱性磷酸酶阳性、SSEA-1阳性、SSEA-3阳性、SSEA-4阳性、TRA-1-81阳性、TRA-1-60阳性、OCT-4阳性，细胞保持正常的染色体核型46、XX；经体内及体外分化实验证实具有三个胚层的组织。 　　（2）利用冷冻胚胎培养的囊胚，取出内细胞团，接种在胚胎鼠成纤维细胞饲养层上，进行培养传代，已得到两个人胚胎干细胞（ES细胞）系，所培养的ES细胞形态与人胚胎干细胞相同，核大、核仁清楚，胞核与胞浆的比率高，可见1～3个核仁；具有人胚胎干细胞的所有生物学特性，如碱性磷酸酶阳性、SSEA-3阳性、SSEA-4阳性、TRA-1-81阳性、TRA-1-60阳性、OCT-4阳性，细胞保持正常的染色体核型46、XX；经体内及体外分化实验证实具有三个胚层的组织。有一个人胚胎干细胞系在体外连续培养20个月，传代76代，仍保持人胚胎干细胞的所有特性，现已全部冻存，并且初步诱导了神经细胞和心肌细胞。 　　5、与国外同类技术比较：自1998年Thomson和Gearhart两个小组分别报道他们用不同材料，不同方法成功分离建立了具有多方向潜能和永久增殖能力的人胚胎干细胞（ES细胞）系和人胚胎生殖细胞（EG细胞）系（二者统称为人胚胎干细胞系）以来，在美国NIH登记的人类ES细胞系已达78株，但真正能供其他实验室做研究的细胞仅10株。在人ES细胞分离过程中，多使用小鼠原代成纤维细胞（MEF）、无限生长系STO细胞。然而，由于在培养过程中存在异种细胞、蛋白和不明病原微生物污染的可能，这将是胚胎干细胞应用到临床需要克服的障碍之一。也有研究表明成人输卵管内膜间质细胞、胎儿成纤维细胞、骨髓间充质细胞、人包皮细胞等均可作为人类胚胎干细胞培养的饲养细胞，但因其寿命短、来源受限而限制其应用。国外也有报道应用人子宫内膜基质细胞作为饲养细胞培养胚胎干细胞的方法。而在仅有的一例关于人EG细胞系的建系报道中，用MEF作为饲养层没有成功，而用STO饲养层获得成功。本研究在国内外首次应用人子宫内膜基质细胞作为饲养细胞培养人原始生殖细胞，进行传代培养4个多月。 　　6、成果的创造性、先进性 　　①本研究首次在国内利用在IVF周期中剩余的冷冻人胚胎建立的两个细胞系均为人类ES细胞系，具有人胚胎干细胞的所有特征，其中1个干细胞系并在体外连续培养20个月，76代； 　　②首次将人子宫内膜基质细胞作为饲养细胞在体外培养人胚原始生殖细胞，并首次在体外培养达4个多月。 　　③并且初步诱导了神经细胞和心肌细胞。 　　7、作用意义（直接经济效益和社会意义）：人类胚胎干细胞为研究机体各系统的发育分化的调控机制及人造组织器官的移植提供了原材料。但是要真正使胚胎干细胞的研究和应用进入临床领域，就必须建立人类胚胎干细胞系。只有获得能在体外大量增殖的人胚胎干细胞，我们才有足够的“种子”和“材料”进行各类相关研究。因此，人类胚胎干细胞系的建立具有重大的应用价值。

　　1、任务来源： 本课题来源于沈阳市科委重点项目：《人胚胎干细胞的分离、建系及诱导分化为心肌细胞和神经细胞》，项目编号为：1032043-3-05 　　2、应用领域：人胚胎干细胞(embryonic stem cel，ES细胞)主要来自囊胚内细胞团及受精卵发育至桑椹胚之前的早期胚胎细胞，或者从胎儿生殖嵴分离得到的原生殖细胞以及体细胞核转移至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。人ES细胞具有2个显著特征：一是它具有体外高度自我更新的能力，二是它可被定向诱导分化为体内各种细胞类型。人ES细胞有着巨大的医学应用前景，它有可能作为“种子细胞”用于细胞替代疗法，即将人ES细胞定向诱导成某一类型的细胞，然后移植到机体的病变区，以治疗各种难治性疾病，如帕金森氏病、心肌梗死、糖尿病等；人胚胎干细胞有向各种组织分化的潜力。人们不仅可以获得需要的细胞，也有希望获得某个器官，甚至用经过基因改造的人胚胎干细胞培育出没有排斥反应的细胞、组织、器官；通过对其体外分化和定向分化的研究，识别某些靶基因，为人类新基因的发现及其功能的研究提供了一种新方法。 　　3、技术原理：（1）取在沈阳市妇婴医院行子宫切除术患者自愿捐献的子宫内膜及行药物流产患者自愿捐献的受精5～9周流产胎儿，捐献者知情同意，且伦理委员会通过。培养子宫内膜基质细胞，建立其培养系统，将子宫内膜基质细胞制备为饲养细胞。分离受精4～9孕周人胚胎的生殖嵴和肠系膜，将其置入子宫内膜基质细胞作为饲养层的培养体系内，分离培养人原始生殖细胞，并对其进行人类胚胎干细胞生物学特性的检测； 　　（2）行IVF/ICSI助孕患者自愿捐献的冷冻胚胎，捐赠者知情同意和医院伦理委员会讨论通过后，复苏冷冻的胚胎，用G1.3G2.3序贯培养法培养至囊胚，采用免疫外科法分离内细胞团，将其接种在胚胎鼠成纤维细胞饲养层上进行培养，直至干细胞集落出现。用机械法、胶原酶、胰酶法、Dispase法对ES细胞进行传代培养，并对其进行人类胚胎干细胞的生物学特性的检测。 　　4、性能指标： 　　（1）建立了人子宫内膜基质细胞作为饲养细胞的培养体系，成功地从选择性药物流产胎儿（5～9周）的生殖嵴、肠系膜分离原始生殖细胞，在国内外首次接种在人子宫内膜基质细胞饲养层上，进行传代培养4个多月。所培养的原始生殖细胞体积较大，核质比高，核内有2个以上的核仁，形态与人胚胎干细胞相似，具备人胚胎干细胞的所有生物学特性，如碱性磷酸酶阳性、SSEA-1阳性、SSEA-3阳性、SSEA-4阳性、TRA-1-81阳性、TRA-1-60阳性、OCT-4阳性，细胞保持正常的染色体核型46、XX；具有人胚胎干细胞的所有生物学特性，如碱性磷酸酶阳性、SSEA-1阳性、SSEA-3阳性、SSEA-4阳性、TRA-1-81阳性、TRA-1-60阳性、OCT-4阳性，细胞保持正常的染色体核型46、XX；经体内及体外分化实验证实具有三个胚层的组织。 　　（2）利用冷冻胚胎培养的囊胚，取出内细胞团，接种在胚胎鼠成纤维细胞饲养层上，进行培养传代，已得到两个人胚胎干细胞（ES细胞）系，所培养的ES细胞形态与人胚胎干细胞相同，核大、核仁清楚，胞核与胞浆的比率高，可见1～3个核仁；具有人胚胎干细胞的所有生物学特性，如碱性磷酸酶阳性、SSEA-3阳性、SSEA-4阳性、TRA-1-81阳性、TRA-1-60阳性、OCT-4阳性，细胞保持正常的染色体核型46、XX；经体内及体外分化实验证实具有三个胚层的组织。有一个人胚胎干细胞系在体外连续培养20个月，传代76代，仍保持人胚胎干细胞的所有特性，现已全部冻存，并且初步诱导了神经细胞和心肌细胞。 　　5、与国外同类技术比较：自1998年Thomson和Gearhart两个小组分别报道他们用不同材料，不同方法成功分离建立了具有多方向潜能和永久增殖能力的人胚胎干细胞（ES细胞）系和人胚胎生殖细胞（EG细胞）系（二者统称为人胚胎干细胞系）以来，在美国NIH登记的人类ES细胞系已达78株，但真正能供其他实验室做研究的细胞仅10株。在人ES细胞分离过程中，多使用小鼠原代成纤维细胞（MEF）、无限生长系STO细胞。然而，由于在培养过程中存在异种细胞、蛋白和不明病原微生物污染的可能，这将是胚胎干细胞应用到临床需要克服的障碍之一。也有研究表明成人输卵管内膜间质细胞、胎儿成纤维细胞、骨髓间充质细胞、人包皮细胞等均可作为人类胚胎干细胞培养的饲养细胞，但因其寿命短、来源受限而限制其应用。国外也有报道应用人子宫内膜基质细胞作为饲养细胞培养胚胎干细胞的方法。而在仅有的一例关于人EG细胞系的建系报道中，用MEF作为饲养层没有成功，而用STO饲养层获得成功。本研究在国内外首次应用人子宫内膜基质细胞作为饲养细胞培养人原始生殖细胞，进行传代培养4个多月。 　　6、成果的创造性、先进性 　　①本研究首次在国内利用在IVF周期中剩余的冷冻人胚胎建立的两个细胞系均为人类ES细胞系，具有人胚胎干细胞的所有特征，其中1个干细胞系并在体外连续培养20个月，76代； 　　②首次将人子宫内膜基质细胞作为饲养细胞在体外培养人胚原始生殖细胞，并首次在体外培养达4个多月。 　　③并且初步诱导了神经细胞和心肌细胞。 　　7、作用意义（直接经济效益和社会意义）：人类胚胎干细胞为研究机体各系统的发育分化的调控机制及人造组织器官的移植提供了原材料。但是要真正使胚胎干细胞的研究和应用进入临床领域，就必须建立人类胚胎干细胞系。只有获得能在体外大量增殖的人胚胎干细胞，我们才有足够的“种子”和“材料”进行各类相关研究。因此，人类胚胎干细胞系的建立具有重大的应用价值。