本研究属应用基础研究领域。首先通过在E.coli原核表达系统中克隆、表达、纯化，得到了我们需要的结核分枝杆菌重组蛋白。接下来我们分别利用ELISA方法，检测了临床不同分类人群血清中特异性抗体的反应强度，来确定Rv3425重组蛋白的免疫诊断应用价值；观察了该PPE蛋白在小鼠体内的免疫特性，评价其可否具有成为MTB新型疫苗组分之一的潜力；采取了针对BCG免疫缺陷的重组疫苗策略，构建了可以分泌Ag85B和Rv3425融合蛋白的重组BCG，并且在小鼠中检测了该重组BCG的免疫原性；用rBCG：：Ag85B-Rv3425和BCG免疫C57BL/6小鼠，然后用MTB毒株H37Rv静脉攻击小鼠，通过体重变化、脏器病变、CFU数以及存活率等方面来评价重组疫苗和传统疫苗保护效力的差别。 主要取得了以下研究成果： 1.我们通过基因克隆、原核表达和亲和纯化，成功获取了Rv3425重组蛋白。 2.对重组蛋白Rv3425作为结核病血清学诊断抗原的潜力进行了评价。 我们研究了以重组蛋白Rv3425和两个对照抗原CFP-10，ESAT-6作为包被抗原，检测结核病人和健康对照者血清中特异性抗体的反应强度，发现结核病人血清能特异性识别重组蛋白Rv425，与健康BCG疫苗接种者血清的反应性具有显著的差异（P＜0.0001），且检测到的抗Rv3425重组蛋白的IgG抗体的反应强度基本上同CFP-10等同，并且高于ESAT-6。证明了M.tuberculosis Rv3425具有免疫敏感性和免疫特异性的本质，有希望用于结核病人的血清学诊断。 3.研究了重组Rv3425蛋白的免疫特性，结果表明经过重组Rv3425蛋白免疫之后，小鼠血清中IgG （H+L）、IgG1、IgG2a抗体水平均有所增强；免疫小鼠脾细胞受到特异性抗原刺激后，有较多的淋巴细胞可以分泌表达IFN-γ，并且Rv3425蛋白免疫组IFN-γ，TNFα的分泌量明显高于IFA免疫对照组，而IL-4在两个免疫组中都没有检测到。由此我们可以初步推论PPE蛋白Rv3425有较好的免疫特性，有可能应用于抗结核疫苗的设计。 4.筛选了分泌表达Ag85B和Rv3425融合蛋白的重组BCG菌株并对其免疫学特性进行了研究，结果表明，用rBCG：Ag85B-Rv3425和BCG菌株免疫C57BL/6小鼠后，通过分析小鼠脾细胞IFN-γ的分泌水平，CD4＋、CD8＋ T细胞所占的比例以及抗体IgG水平、IgG2a/IgG1，发现 rBCG：：Ag85B-Rv3425免疫的小鼠可以引起较BCG免疫小鼠更多的抗原特异性T细胞分泌IFN-γ，除此之外，rBCG：：Ag85B-Rv3425免疫的小鼠体液免疫水平也有明显增强。因此我们也可以初步推论该重组疫苗rBCG：Ag85B-Rv3425可能成为抗结核的潜在候选疫苗。 5.研究了重组疫苗rBCG：Ag85B-Rv3425对小鼠的免疫保护效果。皮下免疫C57BL/6小鼠后用结核分枝杆菌毒力标准株H37Rv尾静脉攻击，攻击后6周，9周，12周，观察小鼠脾、肺中菌落计数、组织病理变化以及小鼠的存活率和攻毒前后体重的变化。研究结果显示rBCG：Ag85B-Rv3425免疫的小鼠肺部菌落数较BCG免疫组有差异（p＜0.05），抗酸染色显示rBCG：Ag85B-Rv3425免疫的小鼠肺部组织的结核杆菌数较BCG免疫组也少。我们可以看出，与BCG相比，rBCG：Ag85B-Rv3425能够产生相当甚至更好的保护作用。 研究首次初步证明了BCG缺失的PPE蛋白Rv3425有应用于结核病血清学诊断及作为抗结核疫苗设计的潜力，为进一步开展PPE蛋白的研究奠定了基础。

本研究属应用基础研究领域。首先通过在E.coli原核表达系统中克隆、表达、纯化，得到了我们需要的结核分枝杆菌重组蛋白。接下来我们分别利用ELISA方法，检测了临床不同分类人群血清中特异性抗体的反应强度，来确定Rv3425重组蛋白的免疫诊断应用价值；观察了该PPE蛋白在小鼠体内的免疫特性，评价其可否具有成为MTB新型疫苗组分之一的潜力；采取了针对BCG免疫缺陷的重组疫苗策略，构建了可以分泌Ag85B和Rv3425融合蛋白的重组BCG，并且在小鼠中检测了该重组BCG的免疫原性；用rBCG：：Ag85B-Rv3425和BCG免疫C57BL/6小鼠，然后用MTB毒株H37Rv静脉攻击小鼠，通过体重变化、脏器病变、CFU数以及存活率等方面来评价重组疫苗和传统疫苗保护效力的差别。 主要取得了以下研究成果： 1.我们通过基因克隆、原核表达和亲和纯化，成功获取了Rv3425重组蛋白。 2.对重组蛋白Rv3425作为结核病血清学诊断抗原的潜力进行了评价。 我们研究了以重组蛋白Rv3425和两个对照抗原CFP-10，ESAT-6作为包被抗原，检测结核病人和健康对照者血清中特异性抗体的反应强度，发现结核病人血清能特异性识别重组蛋白Rv425，与健康BCG疫苗接种者血清的反应性具有显著的差异（P＜0.0001），且检测到的抗Rv3425重组蛋白的IgG抗体的反应强度基本上同CFP-10等同，并且高于ESAT-6。证明了M.tuberculosis Rv3425具有免疫敏感性和免疫特异性的本质，有希望用于结核病人的血清学诊断。 3.研究了重组Rv3425蛋白的免疫特性，结果表明经过重组Rv3425蛋白免疫之后，小鼠血清中IgG （H+L）、IgG1、IgG2a抗体水平均有所增强；免疫小鼠脾细胞受到特异性抗原刺激后，有较多的淋巴细胞可以分泌表达IFN-γ，并且Rv3425蛋白免疫组IFN-γ，TNFα的分泌量明显高于IFA免疫对照组，而IL-4在两个免疫组中都没有检测到。由此我们可以初步推论PPE蛋白Rv3425有较好的免疫特性，有可能应用于抗结核疫苗的设计。 4.筛选了分泌表达Ag85B和Rv3425融合蛋白的重组BCG菌株并对其免疫学特性进行了研究，结果表明，用rBCG：Ag85B-Rv3425和BCG菌株免疫C57BL/6小鼠后，通过分析小鼠脾细胞IFN-γ的分泌水平，CD4＋、CD8＋ T细胞所占的比例以及抗体IgG水平、IgG2a/IgG1，发现 rBCG：：Ag85B-Rv3425免疫的小鼠可以引起较BCG免疫小鼠更多的抗原特异性T细胞分泌IFN-γ，除此之外，rBCG：：Ag85B-Rv3425免疫的小鼠体液免疫水平也有明显增强。因此我们也可以初步推论该重组疫苗rBCG：Ag85B-Rv3425可能成为抗结核的潜在候选疫苗。 5.研究了重组疫苗rBCG：Ag85B-Rv3425对小鼠的免疫保护效果。皮下免疫C57BL/6小鼠后用结核分枝杆菌毒力标准株H37Rv尾静脉攻击，攻击后6周，9周，12周，观察小鼠脾、肺中菌落计数、组织病理变化以及小鼠的存活率和攻毒前后体重的变化。研究结果显示rBCG：Ag85B-Rv3425免疫的小鼠肺部菌落数较BCG免疫组有差异（p＜0.05），抗酸染色显示rBCG：Ag85B-Rv3425免疫的小鼠肺部组织的结核杆菌数较BCG免疫组也少。我们可以看出，与BCG相比，rBCG：Ag85B-Rv3425能够产生相当甚至更好的保护作用。 研究首次初步证明了BCG缺失的PPE蛋白Rv3425有应用于结核病血清学诊断及作为抗结核疫苗设计的潜力，为进一步开展PPE蛋白的研究奠定了基础。