1.选题来源与背景 本计划来源为河南省教育厅，计划编号2007330003，建立同时检测临床大样本、多基因多态性的PCR-SSP的方法。 1.1选题背景 近年来，随着科学研究方法的深入及技术手段的发展，研究人员对一些疾病的病因分子基础进行研究表明，许多疾病的发病和某些基因的单核苷酸多态性相关，而某些具有多态性的基因对这些疾病的治疗、诊断又可提供相应的指导。而在普通人群中，研究人员发现不同人种、不同民族的同一基因也具有许多的单核苷酸多态性，而此种多态性与人类的起源、迁徙以及疾病易感性有较强相关性。但是，由于与同一种疾病相关的基因单核苷酸的变异位点可能会有多个，同一人种、同一民族的同一基因的单核苷酸的变异位点也可能会有多个，要确定相关性最强的变异位点就必须有大量的临床样本支持。因此，建立或采用一种较好的研究方法才能加快研究进展，而加强与疾病相关的多态性位点的研究又可对这些疾病的治疗、诊断提供帮助。对于不同民族、不同人种的同一基因单核苷酸多态性的研究也有利于阐明人类的起源、迁徙以及对疾病的易感性。 1.2选题目的 建立大样本、多个基因同时进行多态性分析的序列特异性引物多聚酶链反应的方法，以满足其在临床检验中对某些疾病进行基因多态性鉴定时的应用，或对某些疾病的诊断、治疗提供指导，并在人群迁徙、人种起源以及对疾病的易感性的研究方面加以应用。 1.3选题意义 通过建立一种支持大量临床样本同时进行多个基因型并快速分型的简便方法，便于在处理大量样本时简化实验步骤，减少研究人员的劳动强度并减少基因型的误读，从而降低实验研究的误差。同时，通过对该研究方法的建立，进一步加强对相关基因多态性疾病的研究，从而对相关疾病的预防、诊断及治疗提供帮助。而对于不同民族、不同人种的同一基因单核苷酸多态性的研究也有利于阐明人类的起源、迁徙以及疾病易感性。 2.技术原理及性能指标 2.1技术原理及性能指标 所采集的临床常规患者血样由新乡医学院第二、三附属医院提供，普通临床患者，纳入标准：进行临床普通血液常规检查患者。患者知情并同意。排除标准：不愿意接受本实验检测的患者。所有采集的样本均利用上海生工生物工程公司临床样品基因组DNA抽提试剂盒(SK1341)提取DNA，经琼脂糖凝胶电泳分析DNA片段的完整性，并经OD260与OD280的比值鉴定纯度与浓度，同时将所有样品调整到相同浓度后于-70℃保存，以备后续基因分型进行研究。 根据国内外相应参考文献，确定肿瘤坏死因子TNFα-308A/G位点变异、肿瘤坏死因子TNFα-238G/A位点变异、白细胞介素6-174G/C位点变异、细胞色素P4502D6*10B外显子第188位的C/T位点变异、COMT基因的第472位编码序列的G/A变异、MAOA基因位于第8外显子CDNA顺序的第941位点的G/T变异做为研究对象，以上几种位点的基因多态性均为临床研究较多，应用较广的基因型。而且我院附属医院的儿科与精神科临床力量深厚、临床病人多、临床样本易获得，因此选取以上一些与儿科、精神科密切相关的位点作为研究对象，并根据其基因序列设计相应的特异性引物a、b及公用引物序列。采用序列特异性引物多聚酶链反应进行扩增，在每次扩增时均同时加入内对照基因的引物，以保证无扩增的阴性条带确为引物不配对所致，而非扩增体系的失败所致。经多次比对并优化反应方法，以扩增后的样品直接进行琼脂糖凝胶电泳，以是否出现相应的扩增条带直接作为基因分型的标准，其标准如下：公用引物与引物a或b分别组合后进行扩增，可能出现3种结果： ①当公用引物与引物a可扩增出阳性片段，而公用引物与引物b没有扩增出阳性片段，可判定此样本为纯合子类型aa； ②当公用引物与引物a可扩增出阳性片段，公用引物与引物b亦可扩增出阳性片段，可判定此样本为杂合子ab； ③当公用引物与引物a没有扩增出阳性片段，而公用引物与引物b可扩增出阳性片段，可判定此样本为纯合子类型bb。 电泳时奇数泳道为公用引物与引物a的扩增产物，偶数泳道为公用引物与引物b的扩增产物，其中每一泳道可读出一个基因位点，两个泳道的基因位点可以确定一个样品的基因型，从而快速进行大样本的直接基因型分析。 2.2研究工作的组织与管理 本项目在新乡医学院科技处的管理下，于新乡医学院分子生物研究室开展研究工作。 3.技术的创造性与先进性 建立或采用一种较好的研究方法才能加快对基因多态性所致疾病的研究进展，而加强对与疾病相关的多态性研究又可对这些疾病的治疗、诊断提供帮助。本研究经采用序列特异性引物多聚酶链反应(polymerase chain reaction-sequence specific primers,PCR-SSP)，通过使用内对照控制在PCR反应中可能出现的非特异性扩增，对于不同的引物同时采用统一的经优化的扩增程序，可以简便地通过琼脂糖电泳来直接判定基因型。 本研究方法简便易行，不需要高超的实验技术及复杂的操作和仪器，临床标本为外周血常规采取，所用血量少，仅需数十微升，相应的DNA提取已有成品的试剂盒出售，且价格低廉、效果良好。仅需将临床检测或科研中常用的基因多态性位点设计出特异性的扩增引物，并按照本研究的方法进行PCR扩增、电泳、读取基因型即可，从采集血液样品到获得基因分型的结果所用时间短、成本低。因此已具备在临床的科研及辅助诊断方面推广的条件。 4.技术的成熟程度 目前已成功建立了同时检测临床大样本、多基因多态性的PCR-SSP的方法，对于同一基因变异位点的分型，已可采用统一扩增体系并在同一循环体系中进行多个样本同时扩增，已形成标准化体系，使用该标准化操作进行临床样本基因分型已达到532例，此方法目前已推广应用至其他基因变异位点的研究中，如糖尿病、眼科疾病的基因分析研究中，而且对于动物实验中的基因变异分析也可使用。本研究已发表论文8篇，待发表论文1篇。 5.研究经费的使用与管理 本项目研究经费按照国家规定及相关科研经费管理规定使用，由新乡医学院科技处与财务处管理。 6.应用情况及存在问题 建立同时检测临床大样本、多基因多态性的PCR-SSP的方法，已发表论文8篇。 已在部分临床研究中、学生教学中应用，效果良好，未发现不良后果。

1.选题来源与背景 本计划来源为河南省教育厅，计划编号2007330003，建立同时检测临床大样本、多基因多态性的PCR-SSP的方法。 1.1选题背景 近年来，随着科学研究方法的深入及技术手段的发展，研究人员对一些疾病的病因分子基础进行研究表明，许多疾病的发病和某些基因的单核苷酸多态性相关，而某些具有多态性的基因对这些疾病的治疗、诊断又可提供相应的指导。而在普通人群中，研究人员发现不同人种、不同民族的同一基因也具有许多的单核苷酸多态性，而此种多态性与人类的起源、迁徙以及疾病易感性有较强相关性。但是，由于与同一种疾病相关的基因单核苷酸的变异位点可能会有多个，同一人种、同一民族的同一基因的单核苷酸的变异位点也可能会有多个，要确定相关性最强的变异位点就必须有大量的临床样本支持。因此，建立或采用一种较好的研究方法才能加快研究进展，而加强与疾病相关的多态性位点的研究又可对这些疾病的治疗、诊断提供帮助。对于不同民族、不同人种的同一基因单核苷酸多态性的研究也有利于阐明人类的起源、迁徙以及对疾病的易感性。 1.2选题目的 建立大样本、多个基因同时进行多态性分析的序列特异性引物多聚酶链反应的方法，以满足其在临床检验中对某些疾病进行基因多态性鉴定时的应用，或对某些疾病的诊断、治疗提供指导，并在人群迁徙、人种起源以及对疾病的易感性的研究方面加以应用。 1.3选题意义 通过建立一种支持大量临床样本同时进行多个基因型并快速分型的简便方法，便于在处理大量样本时简化实验步骤，减少研究人员的劳动强度并减少基因型的误读，从而降低实验研究的误差。同时，通过对该研究方法的建立，进一步加强对相关基因多态性疾病的研究，从而对相关疾病的预防、诊断及治疗提供帮助。而对于不同民族、不同人种的同一基因单核苷酸多态性的研究也有利于阐明人类的起源、迁徙以及疾病易感性。 2.技术原理及性能指标 2.1技术原理及性能指标 所采集的临床常规患者血样由新乡医学院第二、三附属医院提供，普通临床患者，纳入标准：进行临床普通血液常规检查患者。患者知情并同意。排除标准：不愿意接受本实验检测的患者。所有采集的样本均利用上海生工生物工程公司临床样品基因组DNA抽提试剂盒(SK1341)提取DNA，经琼脂糖凝胶电泳分析DNA片段的完整性，并经OD260与OD280的比值鉴定纯度与浓度，同时将所有样品调整到相同浓度后于-70℃保存，以备后续基因分型进行研究。 根据国内外相应参考文献，确定肿瘤坏死因子TNFα-308A/G位点变异、肿瘤坏死因子TNFα-238G/A位点变异、白细胞介素6-174G/C位点变异、细胞色素P4502D6*10B外显子第188位的C/T位点变异、COMT基因的第472位编码序列的G/A变异、MAOA基因位于第8外显子CDNA顺序的第941位点的G/T变异做为研究对象，以上几种位点的基因多态性均为临床研究较多，应用较广的基因型。而且我院附属医院的儿科与精神科临床力量深厚、临床病人多、临床样本易获得，因此选取以上一些与儿科、精神科密切相关的位点作为研究对象，并根据其基因序列设计相应的特异性引物a、b及公用引物序列。采用序列特异性引物多聚酶链反应进行扩增，在每次扩增时均同时加入内对照基因的引物，以保证无扩增的阴性条带确为引物不配对所致，而非扩增体系的失败所致。经多次比对并优化反应方法，以扩增后的样品直接进行琼脂糖凝胶电泳，以是否出现相应的扩增条带直接作为基因分型的标准，其标准如下：公用引物与引物a或b分别组合后进行扩增，可能出现3种结果： ①当公用引物与引物a可扩增出阳性片段，而公用引物与引物b没有扩增出阳性片段，可判定此样本为纯合子类型aa； ②当公用引物与引物a可扩增出阳性片段，公用引物与引物b亦可扩增出阳性片段，可判定此样本为杂合子ab； ③当公用引物与引物a没有扩增出阳性片段，而公用引物与引物b可扩增出阳性片段，可判定此样本为纯合子类型bb。 电泳时奇数泳道为公用引物与引物a的扩增产物，偶数泳道为公用引物与引物b的扩增产物，其中每一泳道可读出一个基因位点，两个泳道的基因位点可以确定一个样品的基因型，从而快速进行大样本的直接基因型分析。 2.2研究工作的组织与管理 本项目在新乡医学院科技处的管理下，于新乡医学院分子生物研究室开展研究工作。 3.技术的创造性与先进性 建立或采用一种较好的研究方法才能加快对基因多态性所致疾病的研究进展，而加强对与疾病相关的多态性研究又可对这些疾病的治疗、诊断提供帮助。本研究经采用序列特异性引物多聚酶链反应(polymerase chain reaction-sequence specific primers,PCR-SSP)，通过使用内对照控制在PCR反应中可能出现的非特异性扩增，对于不同的引物同时采用统一的经优化的扩增程序，可以简便地通过琼脂糖电泳来直接判定基因型。 本研究方法简便易行，不需要高超的实验技术及复杂的操作和仪器，临床标本为外周血常规采取，所用血量少，仅需数十微升，相应的DNA提取已有成品的试剂盒出售，且价格低廉、效果良好。仅需将临床检测或科研中常用的基因多态性位点设计出特异性的扩增引物，并按照本研究的方法进行PCR扩增、电泳、读取基因型即可，从采集血液样品到获得基因分型的结果所用时间短、成本低。因此已具备在临床的科研及辅助诊断方面推广的条件。 4.技术的成熟程度 目前已成功建立了同时检测临床大样本、多基因多态性的PCR-SSP的方法，对于同一基因变异位点的分型，已可采用统一扩增体系并在同一循环体系中进行多个样本同时扩增，已形成标准化体系，使用该标准化操作进行临床样本基因分型已达到532例，此方法目前已推广应用至其他基因变异位点的研究中，如糖尿病、眼科疾病的基因分析研究中，而且对于动物实验中的基因变异分析也可使用。本研究已发表论文8篇，待发表论文1篇。 5.研究经费的使用与管理 本项目研究经费按照国家规定及相关科研经费管理规定使用，由新乡医学院科技处与财务处管理。 6.应用情况及存在问题 建立同时检测临床大样本、多基因多态性的PCR-SSP的方法，已发表论文8篇。 已在部分临床研究中、学生教学中应用，效果良好，未发现不良后果。