一、任务来源 　　本项目为甘肃省自然科学研究基金项目，项目编号：0710RJZA001。 　　二、应用领域和技术原理 　　颗粒溶素在疾病的诊治中有重要的应用价值和广泛的应用前景，是免疫学领域的研究热点之一。本研究采用基因工程的方法体外获取重组颗粒溶素蛋白，并以此为免疫原，采用常规杂交瘤技术制备颗粒溶素单克隆抗体，建立ELISA检测人颗粒溶素的平台，为监测人血清颗粒溶素的含量及探讨新的细胞免疫学指标提供可靠的技术支持。 　　三、性能指标 　　（一）在获取了颗粒溶素和穿孔素基因片段的基础上，一方面，利用原核表达体系获取了含15kDa和9kDa颗粒溶素的融合蛋白。另一方面以FMDV 2A替代IRES实现了颗粒溶素和穿孔素真核共表达，发现人颗粒溶素和穿孔素基因共表达能够促进肿瘤细胞凋亡。 （二）利用重组颗粒溶素蛋白，通过杂交瘤技术，得到4株能稳定分泌颗粒溶素mAb杂交瘤细胞株，成功获取了特异性强、效价高且抗原表位不同的颗粒溶素单克隆抗体。 （三）试建ELISA检测平台并初步检测人颗粒溶素发现，肿瘤患者和其他感染性疾病患者中GNLY表达水平确有差异，说明所得单抗用于临床检测可行。 　　四、与国内外同类技术比较 　　目前，虽然国内外有少数实验室利用基因工程获取了重组颗粒溶素并进行了相关研究，但大多数研究都集中在颗粒溶素活性肽－9kDa颗粒溶素上，有关其前体15kDa颗粒溶素的研究较少。国际市场虽有3～5家公司可以提供颗粒溶素单克隆抗体，但价格昂贵，而国内尚未查到抗颗粒溶素单克隆抗体制备的有关报道。 　　五、成果的创造性、先进性 　　（一）利用原核表达体系获取了含15kDa和9kDa颗粒溶素的融合蛋白。 （二）以重组颗粒溶素为免疫原，制备了能稳定分泌抗人颗粒溶素mAb的杂交瘤细胞4株，得到高效价的抗颗粒溶素单克隆抗体。 （三）利用自制的抗人颗粒溶素单克隆抗体，初步建立了人颗粒溶素的ELISA检测技术平台。 （四）用短小自剪切效率高的FMDV 2A替代上下游基因表达不平衡的IRES，实现了颗粒溶素和穿孔素双基因真核共表达，观察了双基因共表达对肺癌细胞的影响。 　　六、作用意义 　　颗粒溶素融合蛋白的获取为颗粒溶素临床新药的开发及生物学特性的研究创造了条件。人颗粒溶素单克隆抗体的制备和ELISA检测技术平台的建立，为颗粒溶素ELISA试剂盒的制备及进一步将颗粒溶素广泛应用于用于临床实验室诊断奠定了良好基础。 　　七、应用前景 　　颗粒溶素单克隆抗体可用于临床免疫学诊断的多种试验，具有广阔的应用前景。国际市场只有3～5家公司可以提供该产品，且价格昂贵，我实验室成功制备了颗粒溶素单克隆抗体，若能够开发研制成功商品化的ELISA试剂盒将具有非常巨大的市场。随着其单克隆抗体的获取和ELISA检测方法的建立，血清颗粒溶素将是评估病毒感染病情和结核活动性及其化学治疗疗效、了解肿瘤患者免疫抑制状态及无创性早期诊断急性排斥反应的良好指标。

　　一、任务来源 　　本项目为甘肃省自然科学研究基金项目，项目编号：0710RJZA001。 　　二、应用领域和技术原理 　　颗粒溶素在疾病的诊治中有重要的应用价值和广泛的应用前景，是免疫学领域的研究热点之一。本研究采用基因工程的方法体外获取重组颗粒溶素蛋白，并以此为免疫原，采用常规杂交瘤技术制备颗粒溶素单克隆抗体，建立ELISA检测人颗粒溶素的平台，为监测人血清颗粒溶素的含量及探讨新的细胞免疫学指标提供可靠的技术支持。 　　三、性能指标 　　（一）在获取了颗粒溶素和穿孔素基因片段的基础上，一方面，利用原核表达体系获取了含15kDa和9kDa颗粒溶素的融合蛋白。另一方面以FMDV 2A替代IRES实现了颗粒溶素和穿孔素真核共表达，发现人颗粒溶素和穿孔素基因共表达能够促进肿瘤细胞凋亡。 （二）利用重组颗粒溶素蛋白，通过杂交瘤技术，得到4株能稳定分泌颗粒溶素mAb杂交瘤细胞株，成功获取了特异性强、效价高且抗原表位不同的颗粒溶素单克隆抗体。 （三）试建ELISA检测平台并初步检测人颗粒溶素发现，肿瘤患者和其他感染性疾病患者中GNLY表达水平确有差异，说明所得单抗用于临床检测可行。 　　四、与国内外同类技术比较 　　目前，虽然国内外有少数实验室利用基因工程获取了重组颗粒溶素并进行了相关研究，但大多数研究都集中在颗粒溶素活性肽－9kDa颗粒溶素上，有关其前体15kDa颗粒溶素的研究较少。国际市场虽有3～5家公司可以提供颗粒溶素单克隆抗体，但价格昂贵，而国内尚未查到抗颗粒溶素单克隆抗体制备的有关报道。 　　五、成果的创造性、先进性 　　（一）利用原核表达体系获取了含15kDa和9kDa颗粒溶素的融合蛋白。 （二）以重组颗粒溶素为免疫原，制备了能稳定分泌抗人颗粒溶素mAb的杂交瘤细胞4株，得到高效价的抗颗粒溶素单克隆抗体。 （三）利用自制的抗人颗粒溶素单克隆抗体，初步建立了人颗粒溶素的ELISA检测技术平台。 （四）用短小自剪切效率高的FMDV 2A替代上下游基因表达不平衡的IRES，实现了颗粒溶素和穿孔素双基因真核共表达，观察了双基因共表达对肺癌细胞的影响。 　　六、作用意义 　　颗粒溶素融合蛋白的获取为颗粒溶素临床新药的开发及生物学特性的研究创造了条件。人颗粒溶素单克隆抗体的制备和ELISA检测技术平台的建立，为颗粒溶素ELISA试剂盒的制备及进一步将颗粒溶素广泛应用于用于临床实验室诊断奠定了良好基础。 　　七、应用前景 　　颗粒溶素单克隆抗体可用于临床免疫学诊断的多种试验，具有广阔的应用前景。国际市场只有3～5家公司可以提供该产品，且价格昂贵，我实验室成功制备了颗粒溶素单克隆抗体，若能够开发研制成功商品化的ELISA试剂盒将具有非常巨大的市场。随着其单克隆抗体的获取和ELISA检测方法的建立，血清颗粒溶素将是评估病毒感染病情和结核活动性及其化学治疗疗效、了解肿瘤患者免疫抑制状态及无创性早期诊断急性排斥反应的良好指标。