一、简要技术说明： 本课题研究内容： 分为四大部分。 第一部分 临床标本的肺炎衣原体检测 （1） 标本的收集分离及DNA提取 心脑血管病例标本来自河北北方学院附属第一医院神经内科及心内科住院的患者；分离血浆及血细胞，后者用于DNA的提取。 （2） CPn抗体的测定 采用ELISA方法测定各组人群血清中CPnIgG、CPnIgA、CPnIgM抗体，实验步骤按试剂盒说明书操作。 第二部分 构建CPn0308和CPn0186原核表达质粒 （1）目的基因扩增：根据GenBank提供的肺炎衣原体AR39株0308、0186基因序列（AE001363），应用Primer Premier 5软件设计一对引物，分别在引物上加入预先选定的酶切位点。利用引物进行PCR扩增，获得目的基因。 （2）pGEX-6p2- Cpn0308/0186的构建与鉴定：用BamHⅠ和NotⅠ同时对PCR扩增产物和原核载体pGEX-6p2行双酶切，常规酚-氯仿法纯化产物，按10:1混合BamHⅠ/NotⅠ处理后的原核载体和PCR产物，T4连接酶连接。次日将连接产物转化入感受态细胞（E.coli,XL1-blue），接种到LB固体选择性培养基，用针对目的基因的PCR法初步筛选阳性克隆。 （3）原核重组质粒鉴定：从阳性克隆的培养物中提取重组质粒，取部分送由公司进行序列测定。同时对提取的重组质粒用针对目的基因的引物做PCR，双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定。 第三部分 重组质粒原核表达 （1）小规模诱导筛选最佳表达量的阳性克隆：参考预实验表达条件，每种重组质粒挑取5个阳性克隆用于小规模诱导表达。取表达的蛋白做SDS-PAGE，确定目的蛋白是否表达并比较每个阳性克隆的表达量，选取最高表达量的克隆保存菌种。 （2）大规模诱导：取保存的甘油菌，以小规模诱导相同的条件进行大规模诱导蛋白表达，收集蛋白备用。 第四部分 免疫原性检测 采用间接ELISA方法测定两种蛋白在心脑血管病患者人群血清中的抗体水平，以确定两种包涵体膜蛋白的免疫原性。进一步通过Western-blot确证。 实验结论 1、成功构建pGEX-6p2-Cpn0308、0186原核表达载体。 2、通过检测心脑血管病人群血清中抗体水平显示高于对照组，表明该蛋白具有较高的免疫原性。 创新点： 1、Cpn0308、0186蛋白在心脑血管病人群中的免疫原性。 2、构建pGEX-6p2-Cpn0308、0186原核表达载体。 二、应用前景 肺炎衣原体（Chlamydia pneumoniae, Cpn）是一类广泛引起呼吸系统及动脉粥样硬化性疾病的严格细胞内寄生的病原体，其复制是在被感染的宿主细胞内形成的包涵体内进行的，而包涵体膜蛋白是包涵体膜的主要组成成分，担负着与宿主成份进行相互作用的重任，并且在感染人群中表现出一定的免疫原性，所以发现研究包涵体膜蛋白的特性、作用机制及在人群中的免疫原性，对于进一步了解衣原体与宿主细胞的相互作用、疫苗的研制中起着重要的作用。 为此本研究从预测的包涵体膜蛋白CPn0308和CPn0186入手，构建肺炎衣原体包涵体膜蛋白基因CPn0308和Cpn0186原核表达载体，在大肠杆菌中诱导表达目的蛋白，并应用间接ELISA法测定人群血清中CPn0308，CPn0186抗体水平，分析CPn0308和Cpn0186的免疫原性，以确定CPn0308和Cpn0186 在Cpn研究中的应用价值，为临床防治Cpn相关疾病、Cpn 核酸疫苗研制奠定理论基础。 在基础理论方面，该课题的研究为进一步深入研究包涵体膜蛋白CPn0308和CPn0186的特性、作用机制及在人群中的免疫原性奠定了基础 在临床方面，为将来临床诊断防治Cpn相关疾病、Cpn 核酸疫苗研制提供了理论基础。 总之，该课题的研究在基础方面取得良好的开端，取得了有价值的研究资料。在临床方面为将来的防治Cpn相关疾病方面奠定了理论基础，具有重要的现实意义。

一、简要技术说明： 本课题研究内容： 分为四大部分。 第一部分 临床标本的肺炎衣原体检测 （1） 标本的收集分离及DNA提取 心脑血管病例标本来自河北北方学院附属第一医院神经内科及心内科住院的患者；分离血浆及血细胞，后者用于DNA的提取。 （2） CPn抗体的测定 采用ELISA方法测定各组人群血清中CPnIgG、CPnIgA、CPnIgM抗体，实验步骤按试剂盒说明书操作。 第二部分 构建CPn0308和CPn0186原核表达质粒 （1）目的基因扩增：根据GenBank提供的肺炎衣原体AR39株0308、0186基因序列（AE001363），应用Primer Premier 5软件设计一对引物，分别在引物上加入预先选定的酶切位点。利用引物进行PCR扩增，获得目的基因。 （2）pGEX-6p2- Cpn0308/0186的构建与鉴定：用BamHⅠ和NotⅠ同时对PCR扩增产物和原核载体pGEX-6p2行双酶切，常规酚-氯仿法纯化产物，按10:1混合BamHⅠ/NotⅠ处理后的原核载体和PCR产物，T4连接酶连接。次日将连接产物转化入感受态细胞（E.coli,XL1-blue），接种到LB固体选择性培养基，用针对目的基因的PCR法初步筛选阳性克隆。 （3）原核重组质粒鉴定：从阳性克隆的培养物中提取重组质粒，取部分送由公司进行序列测定。同时对提取的重组质粒用针对目的基因的引物做PCR，双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定。 第三部分 重组质粒原核表达 （1）小规模诱导筛选最佳表达量的阳性克隆：参考预实验表达条件，每种重组质粒挑取5个阳性克隆用于小规模诱导表达。取表达的蛋白做SDS-PAGE，确定目的蛋白是否表达并比较每个阳性克隆的表达量，选取最高表达量的克隆保存菌种。 （2）大规模诱导：取保存的甘油菌，以小规模诱导相同的条件进行大规模诱导蛋白表达，收集蛋白备用。 第四部分 免疫原性检测 采用间接ELISA方法测定两种蛋白在心脑血管病患者人群血清中的抗体水平，以确定两种包涵体膜蛋白的免疫原性。进一步通过Western-blot确证。 实验结论 1、成功构建pGEX-6p2-Cpn0308、0186原核表达载体。 2、通过检测心脑血管病人群血清中抗体水平显示高于对照组，表明该蛋白具有较高的免疫原性。 创新点： 1、Cpn0308、0186蛋白在心脑血管病人群中的免疫原性。 2、构建pGEX-6p2-Cpn0308、0186原核表达载体。 二、应用前景 肺炎衣原体（Chlamydia pneumoniae, Cpn）是一类广泛引起呼吸系统及动脉粥样硬化性疾病的严格细胞内寄生的病原体，其复制是在被感染的宿主细胞内形成的包涵体内进行的，而包涵体膜蛋白是包涵体膜的主要组成成分，担负着与宿主成份进行相互作用的重任，并且在感染人群中表现出一定的免疫原性，所以发现研究包涵体膜蛋白的特性、作用机制及在人群中的免疫原性，对于进一步了解衣原体与宿主细胞的相互作用、疫苗的研制中起着重要的作用。 为此本研究从预测的包涵体膜蛋白CPn0308和CPn0186入手，构建肺炎衣原体包涵体膜蛋白基因CPn0308和Cpn0186原核表达载体，在大肠杆菌中诱导表达目的蛋白，并应用间接ELISA法测定人群血清中CPn0308，CPn0186抗体水平，分析CPn0308和Cpn0186的免疫原性，以确定CPn0308和Cpn0186 在Cpn研究中的应用价值，为临床防治Cpn相关疾病、Cpn 核酸疫苗研制奠定理论基础。 在基础理论方面，该课题的研究为进一步深入研究包涵体膜蛋白CPn0308和CPn0186的特性、作用机制及在人群中的免疫原性奠定了基础 在临床方面，为将来临床诊断防治Cpn相关疾病、Cpn 核酸疫苗研制提供了理论基础。 总之，该课题的研究在基础方面取得良好的开端，取得了有价值的研究资料。在临床方面为将来的防治Cpn相关疾病方面奠定了理论基础，具有重要的现实意义。