1、任务来源： 　　宜昌市科技发展计划项目，项目编号：A2007302-16。 　　2、应用领域和技术原理： 　　本课题主要应用于医药卫生领域。多糖作为生物调节子（biologic response modifiers，BRMs）激活机体的免疫系统对抗肿瘤已经得到比较系统的研究，如已经应用于临床的香菇多糖，裂褶多糖。然而，同样具有生物调节功能的黑木耳多糖是如何发挥抗肿瘤作用却较少报道。对肿瘤的治疗可通过不同的方法抑制肿瘤细胞的增殖，其中包括诱导肿瘤细胞的分化和凋亡。有两种方法可达到诱导肿瘤细胞的分化和凋亡的目的，一是直接的诱导，应用化学药物直接作用于肿瘤细胞如平面极性化合物，阿糖胞苷等直接与肿瘤细胞作用，诱导其分化和凋亡。另一种方法是间接诱导，即应用免疫调节子激活机体免疫系统促进细胞因子的分泌并在机体的免疫网络中发挥抗肿瘤作用。如CTL，Th，B淋巴细胞，巨噬细胞，NK细胞和LAK细胞等的活化在免疫调节网络的体系中均报道参与机体的抗肿瘤作用。已报道很多多糖通过免疫调节发挥抗肿瘤作用，如灵芝多糖能促进T-淋巴细胞增殖和NK细胞功能，增强外周血单个核细胞TNF-α，IFN-γ，IL-1β产生，抑制淋巴瘤Molt 4细胞的增殖和诱导凋亡，冬虫夏草多糖，茯苓多糖等通过激活外周血单个核细胞诱导白血病U937、HL60细胞的分化。 多糖通过激活机体免疫系统来抗肿瘤被认为是目前治疗肿瘤的一个新途径，其治疗肿瘤存在两方面的优势，一是抑制肿瘤细胞的增殖，包括诱导肿瘤细胞的分化或凋亡，而且分化使肿瘤细胞能向具有正常功能的细胞转化。二是与常用的放化疗相比，多糖对机体几乎没有副作用。黑木耳多糖具有其它抗肿瘤多糖相类似的化学结构，如(1，3) -β-连接的糖苷键[14]；能调节荷瘤小鼠红细胞膜的流动性，增强机体细胞免疫功能[15，16]。因此，我们设想黑木耳多糖不仅能激活机体的免疫功能，而且可能通过机体的免疫调节发挥抗肿瘤作用。 　　本课题通过水提、乙醇沉淀以及色谱柱分离提纯黑木耳多糖（AAP），观察AAP对体外培养人外周血单个核细胞（PBMCs）增殖和细胞因子表达的影响；研究AAP以及AAP作用于体外培养PBMCs的上清液对人红白血病K562细胞增殖和凋亡的影响。探讨AAP免疫调节和抗肿瘤的分子机制，为开发和利用黑木耳这一丰富的药用资源具有指导意义，也为开发一个可能的新药奠定基础。 　　3、主要技术性能指标： 　　本课题在体外观察黑木耳多糖对人红白血病K562细胞株增殖和凋亡的影响，探讨黑木耳多糖的抗肿瘤作用及其机制。研究采用水提、乙醇沉淀及Sevag法除蛋白分离提取黑木耳多糖（AAP）。以DEAE-纤维素-52离子交换柱对黑木耳多糖进行纯化，并检测AAP多糖含量；体外培养人外周血单个核细胞（PBMCs）72h，以CCK-8试剂检测AAP对PBMCs增殖活性的影响。收集细胞培养上清液，检测TNF-α和IFN-γ的含量。将K562细胞与AAP2以及AAP2作用于体外培养PBMCs的上清液培养，用MTT法和流式细胞仪分别检测K562细胞增殖、细胞周期和凋亡率。 研究结果显示：从黑木耳中分离到的3个多糖组分在100～800mg/ml剂量范围内对PBMCs均有不同程度的促进增殖作用；其中组分AAP2能显著增加PBMCs细胞培养上清中TNF-α和IFN-γ的浓度，并显示剂量依赖效应。AAP2对K562细胞没有显示直接的细胞毒作用；AAP2作用的PBMCs上清能显著抑制K562细胞的增殖，抑制率最大可达49.68﹪；能使G0/G1期细胞显著增加；200mg/ml到800mg/ml浓度AAP2刺激的PBMCs上清液能显著诱导K562细胞凋亡，其凋亡率可达24.70﹪。研究表明：黑木耳多糖能抑制肿瘤细胞的生长，其抗肿瘤的作用机制可能是激活免疫系统，通过刺激免疫细胞细胞因子的表达，诱导肿瘤细胞凋亡并使细胞阻滞于G0/G1期。 　　4、与国内外同类技术比较： 　　国内学者对黑木耳多糖的抗肿瘤作用进行了研究，其研究多来源于动物实验。宗灿华等通过实验观察表明低、中、高剂量黑木耳多糖对H22 肝癌小鼠抑瘤率分别为24.17﹪、32.48﹪、41.21﹪。可提高脾指数和胸腺指数及血清NO含量，推测其抑瘤作用可能与提高机体免疫功能及增加血清NO含量有关。黄滨南等实验研究结果表明，黑木耳多糖可显著延长H22小鼠的生存时间，小鼠对S180实体瘤具有一定的抑制作用，其胸腺指数和脾指数均有不同程度的提高，并能提高小鼠SOD及CAT酶的活力。张秀娟等实验表明，黑木耳多糖能改善S180荷瘤小鼠和H22小鼠红细胞膜的流动性（减低或增加），增强荷瘤小鼠红细胞免疫黏附H22肿瘤细胞的能力。促进淋巴细胞的增殖、提高IL-2的产生、提高淋巴细胞内钙离子浓度。提示黑木耳多糖的抗肿瘤作用机制可能与影响红细胞膜流动性、改善肿瘤造成的免疫抑制、增强红细胞膜活性和调节机体的细胞免疫功能有关。还有学者认为黑木耳多糖可明显增强体液免疫和细胞免疫功能。目前国内外在细胞分子水平来探讨黑木耳多糖免疫调节和抗肿瘤作用的研究还未见报道。 　　5、成果的创造性、先进性： 　　本课题研究成果的创造性和先进性表现在以下几个方面： 1、通过对黑木耳多糖提取纯化，尽可能的排除了黑木耳中非多糖成分对研究结果的影响。 2、研究黑木耳多糖对人红白血病K562肿瘤细胞的直接作用，探讨了黑木耳多糖的直接细胞毒性。 3、体外模拟黑木耳多糖对免疫网络的调节作用，应用ELISA、流式细胞仪等分子生物学技术探讨黑木耳多糖免疫调节和抗肿瘤作用及其可能的机制。 这一研究成果为我国传统药食两用真菌黑木耳及其多糖成分的进一步开发应用提供实验数据。经宜昌市科技情报研究所文献查新，报告显示本课题研究的内容国内相关文献中未见报道。 　　6、作用意义（直接经济效益和社会意义）： 　　本课题从细胞、分子水平初步探了黑木耳多糖免疫调节和体外抗肿瘤作用，并对其可能的抗肿瘤作用机制进行了分析。研究显示黑木耳多糖具有免疫调节和抗肿瘤作用，其抗肿瘤功效的发挥是通过激活免疫细胞，促进免疫网络的调节而实现，这为黑木耳及其多糖成分的开发应用提供科学依据。 　　7、推广应用的范围、条件和前景以及存在的问题和改进意见： 　　目前，由于真菌多糖研究的兴起，黑木耳作为我国最为广泛应用的药食两用真菌之一，其多糖成分的研究已经成为分子生物学、药学和食品科学的重要部分。黑木耳多糖作为可能的抗肿瘤和免疫调节剂与现有已经研究成熟的多糖类药物具有相似的结构和功能，同时具有其它抗肿瘤的放化疗无法比拟的无毒副作用的优势。此外，黑木耳在我国分布广泛，来源容易，是一类经济、开发前景广阔的真菌多糖。 当前存在的主要问题存在几个方面：一是对具有抗肿瘤作用的黑木耳多糖结构以及其构效关系不明；其次是稳定、均一的活性多糖组分很难被大量的分离纯化；三是黑木耳多糖抗肿瘤作用的信号转导途径如配体、受体不清，还有待研究。因此，今后的研究方向将从这三方面开展，首先是多糖的纯化，筛选更加高效的多糖组分，同时分析其分子结构，研究构效关系，探讨其抗肿瘤、免疫调节的信号转导途径等。

　　1、任务来源： 　　宜昌市科技发展计划项目，项目编号：A2007302-16。 　　2、应用领域和技术原理： 　　本课题主要应用于医药卫生领域。多糖作为生物调节子（biologic response modifiers，BRMs）激活机体的免疫系统对抗肿瘤已经得到比较系统的研究，如已经应用于临床的香菇多糖，裂褶多糖。然而，同样具有生物调节功能的黑木耳多糖是如何发挥抗肿瘤作用却较少报道。对肿瘤的治疗可通过不同的方法抑制肿瘤细胞的增殖，其中包括诱导肿瘤细胞的分化和凋亡。有两种方法可达到诱导肿瘤细胞的分化和凋亡的目的，一是直接的诱导，应用化学药物直接作用于肿瘤细胞如平面极性化合物，阿糖胞苷等直接与肿瘤细胞作用，诱导其分化和凋亡。另一种方法是间接诱导，即应用免疫调节子激活机体免疫系统促进细胞因子的分泌并在机体的免疫网络中发挥抗肿瘤作用。如CTL，Th，B淋巴细胞，巨噬细胞，NK细胞和LAK细胞等的活化在免疫调节网络的体系中均报道参与机体的抗肿瘤作用。已报道很多多糖通过免疫调节发挥抗肿瘤作用，如灵芝多糖能促进T-淋巴细胞增殖和NK细胞功能，增强外周血单个核细胞TNF-α，IFN-γ，IL-1β产生，抑制淋巴瘤Molt 4细胞的增殖和诱导凋亡，冬虫夏草多糖，茯苓多糖等通过激活外周血单个核细胞诱导白血病U937、HL60细胞的分化。 多糖通过激活机体免疫系统来抗肿瘤被认为是目前治疗肿瘤的一个新途径，其治疗肿瘤存在两方面的优势，一是抑制肿瘤细胞的增殖，包括诱导肿瘤细胞的分化或凋亡，而且分化使肿瘤细胞能向具有正常功能的细胞转化。二是与常用的放化疗相比，多糖对机体几乎没有副作用。黑木耳多糖具有其它抗肿瘤多糖相类似的化学结构，如(1，3) -β-连接的糖苷键[14]；能调节荷瘤小鼠红细胞膜的流动性，增强机体细胞免疫功能[15，16]。因此，我们设想黑木耳多糖不仅能激活机体的免疫功能，而且可能通过机体的免疫调节发挥抗肿瘤作用。 　　本课题通过水提、乙醇沉淀以及色谱柱分离提纯黑木耳多糖（AAP），观察AAP对体外培养人外周血单个核细胞（PBMCs）增殖和细胞因子表达的影响；研究AAP以及AAP作用于体外培养PBMCs的上清液对人红白血病K562细胞增殖和凋亡的影响。探讨AAP免疫调节和抗肿瘤的分子机制，为开发和利用黑木耳这一丰富的药用资源具有指导意义，也为开发一个可能的新药奠定基础。 　　3、主要技术性能指标： 　　本课题在体外观察黑木耳多糖对人红白血病K562细胞株增殖和凋亡的影响，探讨黑木耳多糖的抗肿瘤作用及其机制。研究采用水提、乙醇沉淀及Sevag法除蛋白分离提取黑木耳多糖（AAP）。以DEAE-纤维素-52离子交换柱对黑木耳多糖进行纯化，并检测AAP多糖含量；体外培养人外周血单个核细胞（PBMCs）72h，以CCK-8试剂检测AAP对PBMCs增殖活性的影响。收集细胞培养上清液，检测TNF-α和IFN-γ的含量。将K562细胞与AAP2以及AAP2作用于体外培养PBMCs的上清液培养，用MTT法和流式细胞仪分别检测K562细胞增殖、细胞周期和凋亡率。 研究结果显示：从黑木耳中分离到的3个多糖组分在100～800mg/ml剂量范围内对PBMCs均有不同程度的促进增殖作用；其中组分AAP2能显著增加PBMCs细胞培养上清中TNF-α和IFN-γ的浓度，并显示剂量依赖效应。AAP2对K562细胞没有显示直接的细胞毒作用；AAP2作用的PBMCs上清能显著抑制K562细胞的增殖，抑制率最大可达49.68﹪；能使G0/G1期细胞显著增加；200mg/ml到800mg/ml浓度AAP2刺激的PBMCs上清液能显著诱导K562细胞凋亡，其凋亡率可达24.70﹪。研究表明：黑木耳多糖能抑制肿瘤细胞的生长，其抗肿瘤的作用机制可能是激活免疫系统，通过刺激免疫细胞细胞因子的表达，诱导肿瘤细胞凋亡并使细胞阻滞于G0/G1期。 　　4、与国内外同类技术比较： 　　国内学者对黑木耳多糖的抗肿瘤作用进行了研究，其研究多来源于动物实验。宗灿华等通过实验观察表明低、中、高剂量黑木耳多糖对H22 肝癌小鼠抑瘤率分别为24.17﹪、32.48﹪、41.21﹪。可提高脾指数和胸腺指数及血清NO含量，推测其抑瘤作用可能与提高机体免疫功能及增加血清NO含量有关。黄滨南等实验研究结果表明，黑木耳多糖可显著延长H22小鼠的生存时间，小鼠对S180实体瘤具有一定的抑制作用，其胸腺指数和脾指数均有不同程度的提高，并能提高小鼠SOD及CAT酶的活力。张秀娟等实验表明，黑木耳多糖能改善S180荷瘤小鼠和H22小鼠红细胞膜的流动性（减低或增加），增强荷瘤小鼠红细胞免疫黏附H22肿瘤细胞的能力。促进淋巴细胞的增殖、提高IL-2的产生、提高淋巴细胞内钙离子浓度。提示黑木耳多糖的抗肿瘤作用机制可能与影响红细胞膜流动性、改善肿瘤造成的免疫抑制、增强红细胞膜活性和调节机体的细胞免疫功能有关。还有学者认为黑木耳多糖可明显增强体液免疫和细胞免疫功能。目前国内外在细胞分子水平来探讨黑木耳多糖免疫调节和抗肿瘤作用的研究还未见报道。 　　5、成果的创造性、先进性： 　　本课题研究成果的创造性和先进性表现在以下几个方面： 1、通过对黑木耳多糖提取纯化，尽可能的排除了黑木耳中非多糖成分对研究结果的影响。 2、研究黑木耳多糖对人红白血病K562肿瘤细胞的直接作用，探讨了黑木耳多糖的直接细胞毒性。 3、体外模拟黑木耳多糖对免疫网络的调节作用，应用ELISA、流式细胞仪等分子生物学技术探讨黑木耳多糖免疫调节和抗肿瘤作用及其可能的机制。 这一研究成果为我国传统药食两用真菌黑木耳及其多糖成分的进一步开发应用提供实验数据。经宜昌市科技情报研究所文献查新，报告显示本课题研究的内容国内相关文献中未见报道。 　　6、作用意义（直接经济效益和社会意义）： 　　本课题从细胞、分子水平初步探了黑木耳多糖免疫调节和体外抗肿瘤作用，并对其可能的抗肿瘤作用机制进行了分析。研究显示黑木耳多糖具有免疫调节和抗肿瘤作用，其抗肿瘤功效的发挥是通过激活免疫细胞，促进免疫网络的调节而实现，这为黑木耳及其多糖成分的开发应用提供科学依据。 　　7、推广应用的范围、条件和前景以及存在的问题和改进意见： 　　目前，由于真菌多糖研究的兴起，黑木耳作为我国最为广泛应用的药食两用真菌之一，其多糖成分的研究已经成为分子生物学、药学和食品科学的重要部分。黑木耳多糖作为可能的抗肿瘤和免疫调节剂与现有已经研究成熟的多糖类药物具有相似的结构和功能，同时具有其它抗肿瘤的放化疗无法比拟的无毒副作用的优势。此外，黑木耳在我国分布广泛，来源容易，是一类经济、开发前景广阔的真菌多糖。 当前存在的主要问题存在几个方面：一是对具有抗肿瘤作用的黑木耳多糖结构以及其构效关系不明；其次是稳定、均一的活性多糖组分很难被大量的分离纯化；三是黑木耳多糖抗肿瘤作用的信号转导途径如配体、受体不清，还有待研究。因此，今后的研究方向将从这三方面开展，首先是多糖的纯化，筛选更加高效的多糖组分，同时分析其分子结构，研究构效关系，探讨其抗肿瘤、免疫调节的信号转导途径等。