技术说明： 胰岛移植是公认最有前途的治愈糖尿病的疗法，随着胰岛移植相关技术的不断进步，胰岛供体短缺已经成为胰岛移植领域主要问题和困惑。因此学者们一直致力于研究如何使胰岛细胞获得持续增殖能力，即实现细胞永生化。当端粒缩短至一定限制长度时，细胞脱离细胞周期而停止生长。端粒序列的复制依赖于细胞内端粒酶的作用。人端粒酶逆转录酶（Human Telomerase Reverse Transcriptase，hTERT）是人端粒酶的重要功能亚单位。已有研究表明，当外源性hTERT转入少数目的细胞后，端粒酶被激活，以自身RNA为模板不断合成端粒DNA来补充和延长端粒末端，恢复染色体的稳定性，使细胞逾越M2期而发生永生化。本研究通过转染hTERT基因而成功实现了人类胎儿胰岛β细胞的永生化,而且与以往的胰岛β细胞系不同，本研究所建细胞系在体外培养和体内生长过程中均无致瘤性。 本研究通过构建hTERT／pLPCX重组逆转录病毒载体，并在PT67包装细胞中表达生产含hTERT基因片段的病毒颗粒。在符合伦理学原则的前提下，取人类自然流产胎儿胰腺进行胰岛细胞的分离和单细胞培养。利用上述病毒颗粒转染hTERT基因至胰岛细胞，经克隆纯化建立人类胎儿胰岛β细胞系，持续体外培养约八个月、传至第56代，细胞仍生长旺盛。该细胞系在长期体外培养过程中在形态上发生由上皮细胞样向间充质细胞样转分化（epithelial mesenchymal transdifferentiation,EMT），但经无血清培养剂DMEM/F12体外诱导分化后EMT可以逆转，并形成胰岛样结构。RT-PCR证实该细胞系除表达hTERT外，还表达与胰岛发育分化关系密切的基因Isl-1、hNKx6.1、PDX-1。免疫组化证实该细胞系表达hTERT蛋白。利用细胞培养上清液进行ELISA法检测证实该细胞系在发生EMT前及经体外诱导分化后具备胰岛素分泌能力。软琼脂克隆形成实验和裸鼠皮下成瘤试验证实该细胞系在体外培养和体内生长过程中均无致瘤性。以手术切除整个胰腺的方法建立SCID小鼠糖尿病模型，并利用所建细胞系作供体进行细胞移植，以研究其对糖尿病的治疗作用。术后21天、28天，移植组小鼠体重明显高于对照组（P＜0.05）。术后28天，与对照组相比，移植组小鼠血糖显著降低，而血胰岛素及C肽水平明显增高（P＜0.05）。研究结论： ①通过逆转录病毒介导hTERT基因转染的方法，成功建立了永生化人类胎儿胰岛β细胞系； ②该细胞系具备胰岛素分泌能力。 ③该细胞系在体外培养和体内生长过程中均无致瘤性。 ④利用该细胞系进行细胞移植改善了糖尿病模型小鼠的高血糖状态，故永生化人胰岛β细胞系可能被应用于细胞移植治疗糖尿病。 主要技术性能指标： 1.通过逆转录病毒介导hTERT基因转染，经克隆纯化建立人类胎儿胰岛β细胞系，持续体外培养约八个月、传至第56代，细胞仍生长旺盛，成功建立了永生化人类胎儿胰岛β细胞系； 2.该细胞系除表达hTERT外，还表达与胰岛发育分化关系密切的基因Isl-1、hNKx 6.1、PDX-1； 3.该细胞系在长期体外培养过程中可发生EMT变化，但经体外分化诱导后EMT可以逆转，并形成胰岛样结构；永生化细胞发生EMT前及经体外分化诱导逆转EMT后，均能分泌胰岛素； 4.软琼脂克隆形成实验和裸鼠皮下成瘤试验证实该细胞系在体外培养和体内生长过程中均不具有致瘤性；⑸永生化人类胎儿胰岛β细胞可存活于糖尿病小鼠体内，并且具有增加其血胰岛素及C肽水平、降低糖尿病小鼠血糖的作用，故永生化人胰岛β细胞系可能被应用于细胞移植治疗糖尿病。 二、推广应用前景与措施 该研究成果在解决普遍面临的胰岛移植供体短缺方面有了较大的创新与突破，所建细胞系在基础研究和实验治疗方面具有较高的实用价值。目前可能被应用于体外实验研究和动物体内实验研究，也可能被应用于糖尿病治疗药物的药理和毒理研究。推广措施：向相关实验室提供所建细胞系作相关体外研究，在进行慎重的安全性评估的基础上推荐应用于进一步的动物体内研究。

技术说明： 胰岛移植是公认最有前途的治愈糖尿病的疗法，随着胰岛移植相关技术的不断进步，胰岛供体短缺已经成为胰岛移植领域主要问题和困惑。因此学者们一直致力于研究如何使胰岛细胞获得持续增殖能力，即实现细胞永生化。当端粒缩短至一定限制长度时，细胞脱离细胞周期而停止生长。端粒序列的复制依赖于细胞内端粒酶的作用。人端粒酶逆转录酶（Human Telomerase Reverse Transcriptase，hTERT）是人端粒酶的重要功能亚单位。已有研究表明，当外源性hTERT转入少数目的细胞后，端粒酶被激活，以自身RNA为模板不断合成端粒DNA来补充和延长端粒末端，恢复染色体的稳定性，使细胞逾越M2期而发生永生化。本研究通过转染hTERT基因而成功实现了人类胎儿胰岛β细胞的永生化,而且与以往的胰岛β细胞系不同，本研究所建细胞系在体外培养和体内生长过程中均无致瘤性。 本研究通过构建hTERT／pLPCX重组逆转录病毒载体，并在PT67包装细胞中表达生产含hTERT基因片段的病毒颗粒。在符合伦理学原则的前提下，取人类自然流产胎儿胰腺进行胰岛细胞的分离和单细胞培养。利用上述病毒颗粒转染hTERT基因至胰岛细胞，经克隆纯化建立人类胎儿胰岛β细胞系，持续体外培养约八个月、传至第56代，细胞仍生长旺盛。该细胞系在长期体外培养过程中在形态上发生由上皮细胞样向间充质细胞样转分化（epithelial mesenchymal transdifferentiation,EMT），但经无血清培养剂DMEM/F12体外诱导分化后EMT可以逆转，并形成胰岛样结构。RT-PCR证实该细胞系除表达hTERT外，还表达与胰岛发育分化关系密切的基因Isl-1、hNKx6.1、PDX-1。免疫组化证实该细胞系表达hTERT蛋白。利用细胞培养上清液进行ELISA法检测证实该细胞系在发生EMT前及经体外诱导分化后具备胰岛素分泌能力。软琼脂克隆形成实验和裸鼠皮下成瘤试验证实该细胞系在体外培养和体内生长过程中均无致瘤性。以手术切除整个胰腺的方法建立SCID小鼠糖尿病模型，并利用所建细胞系作供体进行细胞移植，以研究其对糖尿病的治疗作用。术后21天、28天，移植组小鼠体重明显高于对照组（P＜0.05）。术后28天，与对照组相比，移植组小鼠血糖显著降低，而血胰岛素及C肽水平明显增高（P＜0.05）。研究结论： ①通过逆转录病毒介导hTERT基因转染的方法，成功建立了永生化人类胎儿胰岛β细胞系； ②该细胞系具备胰岛素分泌能力。 ③该细胞系在体外培养和体内生长过程中均无致瘤性。 ④利用该细胞系进行细胞移植改善了糖尿病模型小鼠的高血糖状态，故永生化人胰岛β细胞系可能被应用于细胞移植治疗糖尿病。 主要技术性能指标： 1.通过逆转录病毒介导hTERT基因转染，经克隆纯化建立人类胎儿胰岛β细胞系，持续体外培养约八个月、传至第56代，细胞仍生长旺盛，成功建立了永生化人类胎儿胰岛β细胞系； 2.该细胞系除表达hTERT外，还表达与胰岛发育分化关系密切的基因Isl-1、hNKx 6.1、PDX-1； 3.该细胞系在长期体外培养过程中可发生EMT变化，但经体外分化诱导后EMT可以逆转，并形成胰岛样结构；永生化细胞发生EMT前及经体外分化诱导逆转EMT后，均能分泌胰岛素； 4.软琼脂克隆形成实验和裸鼠皮下成瘤试验证实该细胞系在体外培养和体内生长过程中均不具有致瘤性；⑸永生化人类胎儿胰岛β细胞可存活于糖尿病小鼠体内，并且具有增加其血胰岛素及C肽水平、降低糖尿病小鼠血糖的作用，故永生化人胰岛β细胞系可能被应用于细胞移植治疗糖尿病。 二、推广应用前景与措施 该研究成果在解决普遍面临的胰岛移植供体短缺方面有了较大的创新与突破，所建细胞系在基础研究和实验治疗方面具有较高的实用价值。目前可能被应用于体外实验研究和动物体内实验研究，也可能被应用于糖尿病治疗药物的药理和毒理研究。推广措施：向相关实验室提供所建细胞系作相关体外研究，在进行慎重的安全性评估的基础上推荐应用于进一步的动物体内研究。