任务来源：自选。 　　应用领域：临床诊断。 　　技术原理： 　　1、通过Internet在Genbank中查找NICU中常见及相关菌株的16SrDNA序列，通过DNAstar、Clustalx软件进行种内比较，找出种内所有相同的基因片段，在一个代表序列上作记号，将种内代表序列与83个菌种的代表序列进行种间比较，找出其中差异最大，独具特点的种特异性片段，随后在种特异性片段间用Primer5.0进行特异性探针的设计。根据探针序列所在的集中位置，利用Clustalx软件比对出引物扩增范围内所有细菌均具有的基因序列，并在此序列内设计出细菌的通用探针。根据探针序列所在区域，确定PCR扩增的适宜范围，在区域两端保守序列中设计一对通用引物。 　　2、用通用引物PCR扩增金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌、阴沟杆菌、大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌、肺炎链球菌、表皮葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、婴儿沙门氏菌、粪链球菌、枯草芽胞杆菌、鲍曼氏不动杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、弗劳地枸椽酸杆菌、产气不动杆菌、流感嗜血杆菌等标准实验菌及轮状病毒、人白细胞DNA，以探讨16SrDNA通用引物的广谱性与特异性。 　　3、将设计的细菌特异性探针经过修饰合成后点在经过活化处理的尼龙膜上形成阵列，与所对应的12种NICU常见致病菌标准株及对照菌的PCR扩增产物在同等条件下进行寡核苷酸阵列杂交，以验证设计探针的特异性。 　　4、取上述常见细菌PCR产物进行杂交，对有杂交结果最低量的产物在紫外分光光度计下测量260nmOD值，计算杂交最低可检测的DNA的量，以探讨寡核苷酸阵列的敏感性。 　　5、用寡核苷酸阵列及细菌自动鉴定仪分别对45株标准菌株及123株野生菌株进行检测，以验证寡核苷酸阵列与细菌自动鉴定仪检测结果的吻合程度。 　　6、用寡核苷酸阵列及传统细菌培养两种方法分别检测568例临床标本，以探讨两种方法哪种更具优势。 　　性能指标：1、设计的通用引物具有广谱性和特异性；2、设计的探针具有特异性；3、寡核苷酸阵列杂交时间由原来的6h，缩短为30min；4、寡核苷酸阵列与细菌自动鉴定仪结果一致可判别寡核苷酸阵列的可行性；5、传统细菌培养阳性的临床标本，寡核苷酸阵列一定为阳性，且后者的阳性率更高。 　　与国内同类技术比较： 　　国内关于细菌快速检测方法的研究，有较多的文献报道。关于应用16SrDNA检测细菌的研究也有报道，但应用16SrDNA寡核苷酸探针制作寡核苷酸阵列快速检测NICU常见致病菌的研究只在本项目组发表的文献中有报道。关于细菌DNA的提取方法国内有很多报道，但关于革兰氏阳性细菌DNA的快速提取方法国内未见有相同报道。关于细菌的保存方法国内有较多报道，但关于医用安瓿加鸡蛋保存液的方法国内未见报道。传统细菌培养所需时间一般需要48h以上，常导致病人无法得到及时有效的治疗，同时可能因为使用无效的抗生素而导致病原菌抗性的积累。更重要的是许多病原菌难培养或者不能被培养出来，用传统的血清学和生化与形态方法诊断是无法实现的。在本研究的细菌检测中由于对杂交条件的优化，使杂交时间由原来的6h缩短为30min，故应用寡核苷酸阵列检测致病菌可快速为临床诊断、治疗提供依据。 　　成果的创造性：1、设计出细菌的通用引物；2、成功设计出检测NICU常见致病菌的寡核苷酸特异性探针；3、成功建立了以16SrDNA为对象的寡核苷酸阵列检测方法；4、成功利用寡核苷酸阵列对12种NICU常见致病菌进行了检测；5、配制出了与寡核苷酸阵列相配套的快速杂交液。使杂交时间由原来的6h缩短为30min；6、摸索出尼龙膜处理的特殊方法，使探针固定明显加强；7、创新了一种实用菌保存的方法；8、探寻出快速提取革兰氏阳性球菌DNA的方法。 　　作用意义：采用寡核苷酸阵列检测技术，可大大提高病原微生物的检测效率，缩短检测时间，指导临床合理使用抗生素，实现有效控制感染。该方法是临床病原微生物检测发展的必然趋势。建立寡核苷酸检测技术具有现实意义。 　　推广应用的范围：医院。推广应用的条件：拥有PCR仪、杂交工作箱的医院或科室均可开展此项目。推广应用的前景：该项目具有快速、敏感、特异性强、阳性率高的特点，具有良好的推广应用前景。存在的问题：1、目前采用16SrDNA寡核苷酸阵列检测的细菌数量有限；2、不能提供细菌的耐药及药敏情况。改进意见：继续筛选更多细菌的特异性探针，以检测更多的细菌；筛选出细菌的耐药基因，为临床提供细菌的耐药性。

　　任务来源：自选。 　　应用领域：临床诊断。 　　技术原理： 　　1、通过Internet在Genbank中查找NICU中常见及相关菌株的16SrDNA序列，通过DNAstar、Clustalx软件进行种内比较，找出种内所有相同的基因片段，在一个代表序列上作记号，将种内代表序列与83个菌种的代表序列进行种间比较，找出其中差异最大，独具特点的种特异性片段，随后在种特异性片段间用Primer5.0进行特异性探针的设计。根据探针序列所在的集中位置，利用Clustalx软件比对出引物扩增范围内所有细菌均具有的基因序列，并在此序列内设计出细菌的通用探针。根据探针序列所在区域，确定PCR扩增的适宜范围，在区域两端保守序列中设计一对通用引物。 　　2、用通用引物PCR扩增金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌、阴沟杆菌、大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌、肺炎链球菌、表皮葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、婴儿沙门氏菌、粪链球菌、枯草芽胞杆菌、鲍曼氏不动杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、弗劳地枸椽酸杆菌、产气不动杆菌、流感嗜血杆菌等标准实验菌及轮状病毒、人白细胞DNA，以探讨16SrDNA通用引物的广谱性与特异性。 　　3、将设计的细菌特异性探针经过修饰合成后点在经过活化处理的尼龙膜上形成阵列，与所对应的12种NICU常见致病菌标准株及对照菌的PCR扩增产物在同等条件下进行寡核苷酸阵列杂交，以验证设计探针的特异性。 　　4、取上述常见细菌PCR产物进行杂交，对有杂交结果最低量的产物在紫外分光光度计下测量260nmOD值，计算杂交最低可检测的DNA的量，以探讨寡核苷酸阵列的敏感性。 　　5、用寡核苷酸阵列及细菌自动鉴定仪分别对45株标准菌株及123株野生菌株进行检测，以验证寡核苷酸阵列与细菌自动鉴定仪检测结果的吻合程度。 　　6、用寡核苷酸阵列及传统细菌培养两种方法分别检测568例临床标本，以探讨两种方法哪种更具优势。 　　性能指标：1、设计的通用引物具有广谱性和特异性；2、设计的探针具有特异性；3、寡核苷酸阵列杂交时间由原来的6h，缩短为30min；4、寡核苷酸阵列与细菌自动鉴定仪结果一致可判别寡核苷酸阵列的可行性；5、传统细菌培养阳性的临床标本，寡核苷酸阵列一定为阳性，且后者的阳性率更高。 　　与国内同类技术比较： 　　国内关于细菌快速检测方法的研究，有较多的文献报道。关于应用16SrDNA检测细菌的研究也有报道，但应用16SrDNA寡核苷酸探针制作寡核苷酸阵列快速检测NICU常见致病菌的研究只在本项目组发表的文献中有报道。关于细菌DNA的提取方法国内有很多报道，但关于革兰氏阳性细菌DNA的快速提取方法国内未见有相同报道。关于细菌的保存方法国内有较多报道，但关于医用安瓿加鸡蛋保存液的方法国内未见报道。传统细菌培养所需时间一般需要48h以上，常导致病人无法得到及时有效的治疗，同时可能因为使用无效的抗生素而导致病原菌抗性的积累。更重要的是许多病原菌难培养或者不能被培养出来，用传统的血清学和生化与形态方法诊断是无法实现的。在本研究的细菌检测中由于对杂交条件的优化，使杂交时间由原来的6h缩短为30min，故应用寡核苷酸阵列检测致病菌可快速为临床诊断、治疗提供依据。 　　成果的创造性：1、设计出细菌的通用引物；2、成功设计出检测NICU常见致病菌的寡核苷酸特异性探针；3、成功建立了以16SrDNA为对象的寡核苷酸阵列检测方法；4、成功利用寡核苷酸阵列对12种NICU常见致病菌进行了检测；5、配制出了与寡核苷酸阵列相配套的快速杂交液。使杂交时间由原来的6h缩短为30min；6、摸索出尼龙膜处理的特殊方法，使探针固定明显加强；7、创新了一种实用菌保存的方法；8、探寻出快速提取革兰氏阳性球菌DNA的方法。 　　作用意义：采用寡核苷酸阵列检测技术，可大大提高病原微生物的检测效率，缩短检测时间，指导临床合理使用抗生素，实现有效控制感染。该方法是临床病原微生物检测发展的必然趋势。建立寡核苷酸检测技术具有现实意义。 　　推广应用的范围：医院。推广应用的条件：拥有PCR仪、杂交工作箱的医院或科室均可开展此项目。推广应用的前景：该项目具有快速、敏感、特异性强、阳性率高的特点，具有良好的推广应用前景。存在的问题：1、目前采用16SrDNA寡核苷酸阵列检测的细菌数量有限；2、不能提供细菌的耐药及药敏情况。改进意见：继续筛选更多细菌的特异性探针，以检测更多的细菌；筛选出细菌的耐药基因，为临床提供细菌的耐药性。