（1）课题来源与背景： 杭州市医药卫生科技计划项目 计划编号：2006B079。 （2）研究目的与意义 霍乱弧菌（Vibrio cholerae）是甲类传染病霍乱的病原菌，属于弧菌科弧菌属，是引起夏秋季腹泻最常见、最重要的病原体之一，传染性非常强，迄今为止共发生过七次世界性大流行。人群对V.cholerae普遍易感，无年龄、性别或种族之差异，也无先天免疫，到目前为止全球尚无十分有效的V.cholerae疫苗面世。1991～1998年每年全球有59～94个国家和地区报告14～59万霍乱病例，从1961年持续至今的第七次世界大流行，五大洲140个以上国家和地区已报病400万例以上，造成生命和财产的巨大损失。我国多个沿海地区包括浙江省在内也是V.cholerae感染的高发地区，历年来我省都有霍乱疫情的发生，去年我省报道嘉兴地区发生霍乱疫情，共检出病人184例，带菌者60例。因此建立快速准确的早期诊断方法十分必要，对及时合理治疗、有效控制疫情传播具有重要意义。 （3）主要论点与论据 1.目前我国针对V.cholerae的检测方法，主要是传统的细菌分离，其操作程序繁琐，耗时费力。随着分子生物学的发展，90年代后研究者陆续将PCR技术引用到霍乱弧菌的检测中，使检测时间大为缩短，但此法需后续电泳等步骤，易交叉污染造成假阳性。 2.近年迅速发展起来的荧光定量PCR技术集合了PCR技术对DNA的高效扩增、探针技术的高特异性和光谱技术的敏感性以及定量等特点，已经在许多病原微生物的快速诊断中得到广泛运用。 3.荧光定量PCR技术解决了传统方法和常规PCR检测的不足，不仅具有快速、灵敏、特异、操作简单、能够对样本进行定量分析等优点，而且整个反应过程在一个密闭管内完成，大大减少了污染机会，防止假阳性的形成。 （4）创见与创新 本课题组从Genbank下载多个V.cholerae的CT基因和rfbO1、rfbO139基因特异性序列，利用生物信息学软件分析后，在其保守区域设计引物和探针，优化反应条件和体系，建立单重、多重荧光定量PCR快速检测方法。 用建立的单重、多重荧光定量PCR检测方法对118份霍乱散发疫情临床样本和352份外环境监测样本进行检测，共检出8株带毒力的霍乱弧菌。 （5）社会经济效益，存在的问题 目前我省及我国部分城市霍乱疫情依然时有发生，就我省而言，2005年嘉兴地区霍乱疫情中共检出病人184例，带菌者60例。因此建立一种快速、敏感、准确、特异的荧光定量PCR检测方法显得十分必要，对及时合理治疗、有效控制疫情传播具有重要意义。 目前该方法在杭州市江干区医学会、科学技术协会优秀论文表彰大会上进行了广泛的推广与交流，对快速诊断试剂的研发利用具有潜在的应用价值。 （6）历年发表论文及获奖情况 本研究结果共形成5篇论文，均发表在国家级杂志上： 1、Taqman荧光定量PCR技术快速检测霍乱弧菌方法的建立.中国卫生检验杂志，2006，16（8）。 2、实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）法与PCR法及传统培养法检测霍乱弧菌的比较.中国预防医学杂志，2007，8。 3、甲鱼及养殖水中检出5株带毒力基因的O1群霍乱弧菌.疾病监测，2010，8。 4、外环境样本中产毒型O1群霍乱弧菌双重荧光定量PCR快速检测方法的建立.中国人兽共患病学报，2011，1 5、TaqMan双重荧光PCR用于快速检测模拟临床标本中产毒型O139群霍乱弧菌的研究.中国卫生检验杂志，2011，21（4）。 论文获奖情况： 论文《Taqman荧光定量PCR技术快速检测霍乱弧菌方法的建立》、《实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）法与PCR法及传统培养法检测霍乱弧菌的比较》分别获得杭州市江干区2006～2007年度科技协会优秀论文一、二等奖和杭州市江干区2005～2007年度医学会优秀论文一、二等奖，并在大会上进行了广泛的推广和交流。

（1）课题来源与背景： 杭州市医药卫生科技计划项目 计划编号：2006B079。 （2）研究目的与意义 霍乱弧菌（Vibrio cholerae）是甲类传染病霍乱的病原菌，属于弧菌科弧菌属，是引起夏秋季腹泻最常见、最重要的病原体之一，传染性非常强，迄今为止共发生过七次世界性大流行。人群对V.cholerae普遍易感，无年龄、性别或种族之差异，也无先天免疫，到目前为止全球尚无十分有效的V.cholerae疫苗面世。1991～1998年每年全球有59～94个国家和地区报告14～59万霍乱病例，从1961年持续至今的第七次世界大流行，五大洲140个以上国家和地区已报病400万例以上，造成生命和财产的巨大损失。我国多个沿海地区包括浙江省在内也是V.cholerae感染的高发地区，历年来我省都有霍乱疫情的发生，去年我省报道嘉兴地区发生霍乱疫情，共检出病人184例，带菌者60例。因此建立快速准确的早期诊断方法十分必要，对及时合理治疗、有效控制疫情传播具有重要意义。 （3）主要论点与论据 1.目前我国针对V.cholerae的检测方法，主要是传统的细菌分离，其操作程序繁琐，耗时费力。随着分子生物学的发展，90年代后研究者陆续将PCR技术引用到霍乱弧菌的检测中，使检测时间大为缩短，但此法需后续电泳等步骤，易交叉污染造成假阳性。 2.近年迅速发展起来的荧光定量PCR技术集合了PCR技术对DNA的高效扩增、探针技术的高特异性和光谱技术的敏感性以及定量等特点，已经在许多病原微生物的快速诊断中得到广泛运用。 3.荧光定量PCR技术解决了传统方法和常规PCR检测的不足，不仅具有快速、灵敏、特异、操作简单、能够对样本进行定量分析等优点，而且整个反应过程在一个密闭管内完成，大大减少了污染机会，防止假阳性的形成。 （4）创见与创新 本课题组从Genbank下载多个V.cholerae的CT基因和rfbO1、rfbO139基因特异性序列，利用生物信息学软件分析后，在其保守区域设计引物和探针，优化反应条件和体系，建立单重、多重荧光定量PCR快速检测方法。 用建立的单重、多重荧光定量PCR检测方法对118份霍乱散发疫情临床样本和352份外环境监测样本进行检测，共检出8株带毒力的霍乱弧菌。 （5）社会经济效益，存在的问题 目前我省及我国部分城市霍乱疫情依然时有发生，就我省而言，2005年嘉兴地区霍乱疫情中共检出病人184例，带菌者60例。因此建立一种快速、敏感、准确、特异的荧光定量PCR检测方法显得十分必要，对及时合理治疗、有效控制疫情传播具有重要意义。 目前该方法在杭州市江干区医学会、科学技术协会优秀论文表彰大会上进行了广泛的推广与交流，对快速诊断试剂的研发利用具有潜在的应用价值。 （6）历年发表论文及获奖情况 本研究结果共形成5篇论文，均发表在国家级杂志上： 1、Taqman荧光定量PCR技术快速检测霍乱弧菌方法的建立.中国卫生检验杂志，2006，16（8）。 2、实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）法与PCR法及传统培养法检测霍乱弧菌的比较.中国预防医学杂志，2007，8。 3、甲鱼及养殖水中检出5株带毒力基因的O1群霍乱弧菌.疾病监测，2010，8。 4、外环境样本中产毒型O1群霍乱弧菌双重荧光定量PCR快速检测方法的建立.中国人兽共患病学报，2011，1 5、TaqMan双重荧光PCR用于快速检测模拟临床标本中产毒型O139群霍乱弧菌的研究.中国卫生检验杂志，2011，21（4）。 论文获奖情况： 论文《Taqman荧光定量PCR技术快速检测霍乱弧菌方法的建立》、《实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）法与PCR法及传统培养法检测霍乱弧菌的比较》分别获得杭州市江干区2006～2007年度科技协会优秀论文一、二等奖和杭州市江干区2005～2007年度医学会优秀论文一、二等奖，并在大会上进行了广泛的推广和交流。