革兰氏阴性杆菌产生的质粒AmpC β-内酰胺酶导致的多重耐药性，给临床抗感染治疗带来了极大困难和挑战，容易造成院内感染的爆发流行，现已引起国内外的高度重视。但目前尚缺乏有效的实验室检测方法，不能及时提供准确耐药机制信息，所以建立一种快速准确地检测质粒AmpC型β-内酰胺酶方法具有重要的意义。 　　本课题受黑龙江省科技厅科技攻关项目的资助。 　　技术原理及性能指标： 　　多重PCR引物设计：在Genbank上检索所有已经公布的质粒AmpC酶基因序列，根据其同源性，将所有质粒AmpC酶分为6组，根据基因保守序列设计6对型特异性引物，扩增片段长度在190～520bp之间；引物二聚体、及引物间的杂交、Tm值用PrimerPremer软件进行分析。多重PCR反应总体积为50L：10×PCR buffer 5L，MgCl2 3L，dNTP 1L，TaqE 0.75L，0.6L的引物MOXMF，MOXMR，CITMF，CITMR，DHAMF和DHAMR；0.5L的ACCMF，ACCMR，EBCMF，EBCMR；0.4L的FOXMF和FOXMR，模板2L。反应参数：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，25个循环，再72℃延伸7min保护。高产ACT-1型质粒AmpC酶作为质粒AmpC酶阳性对照菌株，E.coli ATCC25922为阴性对照株，蒸馏水代替模板做为空白对照。PCR产物进行2﹪琼脂糖凝胶电泳，拍照记录成像。PCR产物纯化和测序由上海生工生物工程公司进行，采用ABIPRISM377DNA测序仪双向测序，测序结果在Genbank经BLAST系统与已知的ampC基因序列进行对比，确定基因型别。 　　技术的创新性和先进性： 　　建立的多重PCR探针检测技术，具有系统性，在同一PCR反应管内对未知所有型别的目的基因进行分型；高效性，对多个目的模板目的基因同时进行分型；同时具有经济简便性，多种病原性模板在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息。 　　技术的成熟程度适用范围和安全性： 　　该技术在一般的PCR实验室就能开展检测，按照PCR实验室管理要求，即可达到安全性。 　　应用情况和安全问题： 　　该检测技术术建立以来，在我单位进行了大量的临床标本的检测，结果满意。此外，该项技术方法还被许多兄弟医院采用，也在全国和本省的继续医学教育培训班中进行了推广。

　　革兰氏阴性杆菌产生的质粒AmpC β-内酰胺酶导致的多重耐药性，给临床抗感染治疗带来了极大困难和挑战，容易造成院内感染的爆发流行，现已引起国内外的高度重视。但目前尚缺乏有效的实验室检测方法，不能及时提供准确耐药机制信息，所以建立一种快速准确地检测质粒AmpC型β-内酰胺酶方法具有重要的意义。 　　本课题受黑龙江省科技厅科技攻关项目的资助。 　　技术原理及性能指标： 　　多重PCR引物设计：在Genbank上检索所有已经公布的质粒AmpC酶基因序列，根据其同源性，将所有质粒AmpC酶分为6组，根据基因保守序列设计6对型特异性引物，扩增片段长度在190～520bp之间；引物二聚体、及引物间的杂交、Tm值用PrimerPremer软件进行分析。多重PCR反应总体积为50L：10×PCR buffer 5L，MgCl2 3L，dNTP 1L，TaqE 0.75L，0.6L的引物MOXMF，MOXMR，CITMF，CITMR，DHAMF和DHAMR；0.5L的ACCMF，ACCMR，EBCMF，EBCMR；0.4L的FOXMF和FOXMR，模板2L。反应参数：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，25个循环，再72℃延伸7min保护。高产ACT-1型质粒AmpC酶作为质粒AmpC酶阳性对照菌株，E.coli ATCC25922为阴性对照株，蒸馏水代替模板做为空白对照。PCR产物进行2﹪琼脂糖凝胶电泳，拍照记录成像。PCR产物纯化和测序由上海生工生物工程公司进行，采用ABIPRISM377DNA测序仪双向测序，测序结果在Genbank经BLAST系统与已知的ampC基因序列进行对比，确定基因型别。 　　技术的创新性和先进性： 　　建立的多重PCR探针检测技术，具有系统性，在同一PCR反应管内对未知所有型别的目的基因进行分型；高效性，对多个目的模板目的基因同时进行分型；同时具有经济简便性，多种病原性模板在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息。 　　技术的成熟程度适用范围和安全性： 　　该技术在一般的PCR实验室就能开展检测，按照PCR实验室管理要求，即可达到安全性。 　　应用情况和安全问题： 　　该检测技术术建立以来，在我单位进行了大量的临床标本的检测，结果满意。此外，该项技术方法还被许多兄弟医院采用，也在全国和本省的继续医学教育培训班中进行了推广。